El ensayo de ligadura de proximidad in situ o PLA, es una tecnología capaz de detectar interacciones entre proteínas, tejido fijado y células. Las asociaciones entre proteínas pueden identificarse y cuantificarse sin necesidad de expresión transgénica ni tecnologías adicionales. El único requisito es la disponibilidad de anticuerpos específicos de alta eficiencia que se pueden modificar con oligonucleótidos de ADN.
En los tejidos MST1 y MST2 existen principalmente como homodímeros activos, pero los estímulos oncogénicos pueden aumentar el nivel de heterodimeros MST1 MST2 y tales heterodímeros están inactivos. Después de la incubación con anticuerpos de imprimación específicos contra las proteínas de interés, se añaden a la ranura anticuerpos secundarios específicos especiales, cada uno vinculado a una cadena de ADN única, corta y gratuita unida a ella, para unirse a los anticuerpos primarios. Si las proteínas en las preguntas son heterodimerizadas, tanto los anticuerpos primarios como los anticuerpos secundarios unidos a ellos estarán muy cerca.
En este estado, las hebras de ADN adjuntas en los segundos anticuerpos pueden interactuar a través de una adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN formadores de círculos. Varios cientos de replicación del círculo de ADN puede ocurrir después de una reacción de amplificación y una señal de fluorescencia es generada por sondas de oligonucleótido de cortesía niveladas. Por lo tanto, cada señal detectada se visualiza como un punto fluorescente individual que se puede asignar a una ubicación subcelular específica basada en imágenes de microscopio.
El día antes del experimento, cubra 16 diapositivas bien bien cuidadas añadiendo 50 a 100 microlitros de laminina de ratón o poli-L-lisina e incubar a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos eliminar la solución fría, dividir las células usando Trypsin y la placa 15,000 a 25, 000 células por pozo en 16 diapositivas bien cámaras. Incubar células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante 24 horas.
Después de 24 horas, retire el medio de los pozos y lave suavemente las células con PBS. Utilice una micropipeta para minimizar la toma de riesgos de la muestra y luego aspire el PBS y fije las células añadiendo 50 microlitros de 4%PFA por pozo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. No pipetee la solución directamente sobre las células, ya que eso puede resultar en el desprendimiento de las células.
Después de la fijación, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos cada una con agitación leve. A continuación, permeabilizar las células e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Una vez completada la permeabilización, lave las células con TBST tres veces durante cinco minutos por lavado con agitación.
Después de eliminar TBST añadir una gota de solución de bloqueo en cada pozo e incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados Centígrados. Diluir los anticuerpos primarios. Retire la solución de bloqueo con una micropipeta, pero no permita que las diapositivas se sequen.
Vórtice y añadir 40 microlitros de la solución de anticuerpos diluidos a los pozos apropiados e incubar las muestras a 37 grados Celsius en una cámara de humedad precalentada durante una hora. Durante la incubación, diluya las dos sondas PLA en el diluyente de anticuerpos. Para cada muestra prepare 40 microlitros de sonda PLA.
Después de una hora de incubación, aspirar la solución de anticuerpos y lavar los portaobjetos dos veces durante cinco minutos con TBST a temperatura ambiente. Retire suavemente el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de sonda PLA a cada pozo. Incubar los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante una hora a 37 grados centígrados.
Vórtice y diluya los volúmenes requeridos de la población de ligadura de 1 a 5 en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso. Se requieren 40 microlitros de la solución de ligadura para cada pocóteo. Después de la incubación, retire la solución PLA de los portaobjetos y lávelos dos veces en TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación.
Utilice un bloque de congelación al eliminar la ligasa del congelador y justo antes de agregarlo a las células, vórtice y diluirlo con la solución de ligadura. Retire el TBST de las diapositivas y agregue 40 microlitros de la solución de ligasa de ligadura a cada pocero. Incubar toboganes en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación aspirar la solución y lavar dos veces con TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación. Evite exponer el pozo a la luz brillante, ya que los reactivos son sensibles a la luz. Durante el último lavado, vórtice y diluir los volúmenes requeridos de solución de amplificación en agua de alta pureza inmediatamente antes de su uso.
Mantener la polimerasa sobre hielo o en un bloque de enfriamiento y justo antes de agregarla al vórtice de las células y diluir con la solución de amplificación. Aspirar el TBST de los pozos y añadir 40 microlitros de solución de amplificación a cada pocólculo. Incubar toboganes en una cámara oscura de humedad precalentada durante 100 minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, aspirar la solución de amplificación polimerasa de los portaobjetos y lavar dos veces diez minutos cada uno en TBST a temperatura ambiente. Retire las cámaras y la silicona alrededor de los pozos de la diapositiva por completo. Raspa las perlas restantes de silicona con una maquinilla de afeitar.
Dibuja una cuadrícula en la diapositiva que separa cada pozo. Agregue aproximadamente 40 microlitros del medio de montaje con DAPI, asegurando que no quede ninguna burbuja de aire atrapada bajo el resbalón de la cubierta. Use esmalte de uñas para fijar el vidrio de la cubierta.
El análisis microscópico se puede realizar en 20 minutos después de la fijación, pero en la práctica nos resulta más conveniente realizar análisis de imágenes al día siguiente. Para analizar las muestras, utilizamos un microscopio de escaneo láser de configuración Leica SP8. Aquí se muestran ejemplos de ensayo de ligadura de proximidad in situ que visualiza la proximidad entre las proteínas MST 1 y MST2 en las células renales embrionarias humanas en los paneles A a D, y las células Schwann humanas en los paneles E a través de H.In todos los núcleos celulares de los paneles son manchados de azul por DAPI y los puntos rojos indican señales de ligadura de proximidad positivas resultantes de la proximidad cercana entre las proteínas indicadas.
El panel A muestra la proximidad de MST1 y MST2 y el panel B muestra la proximidad de ERK y fosfoERK, ya que estos epítopos están en la misma proteína. El Panel C representa un control negativo, ya que estas células como MST1 y MST2 y el Panel D representan un segundo control negativo manchado con anticuerpos para MST1 y ERK que no se espera que estén cerca unos de otros. Los paneles E y F muestran la proximidad de MST1 con MST2 y ERK con fosfoERK en células Schwann.
Los paneles G y H son controles negativos manchados solo con anticuerpos MST1 o con anticuerpos MST1 y ERK. Es imperativo utilizar anticuerpos primarios no reactivos que deben reconocer sólo un miembro del heterodímero. También es importante recordar el uso de diferentes puntas para evitar la contaminación cruzada de anticuerpos primarios y sondas PLA, para evitar tocar el fondo del pozo, y para evitar pipetear directamente en las muestras.
Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar PLA in situ para estudiar la dimerización de proteínas en células fijas.
