Este método podría ayudarnos a responder preguntas clave relacionadas con la expresión génica, mostrándonos exactamente cómo la estructura de la cromatina afecta la expresión génica y cómo la organización de la cromatina regula la dinámica transcripcional. Desarrollamos esta tecnología porque queríamos ser capaces de alterar la arquitectura cromosómica para permitir la creación de bucles de cromatina de largo alcance. Mientras que al mismo tiempo tienen la capacidad de invertir el contexto de la cromatina para restaurar la estructura cromosómica endógena.
Este método fue diseñado para facilitar el uso y una amplia aplicabilidad. Aprovechamos un dimerizer no tóxico, así como especies ortogonales de dcas9 con el fin de permitir que el sistema se utilice más ampliamente. Desarrollamos este método porque queríamos ser capaces de responder a la pregunta de pollo y huevo de larga data de si la expresión génica engendra arquitectura cromosómica o si la estructura cromosómica conduce a cambios en la expresión génica.
El diseño de las secuencias de ARN de guía CRISPR y el mantenimiento de los cultivos celulares se describen en el protocolo de texto. Los mapas de plásmido y las imprimaciones utilizadas se enumeran allí. Comience la preparación del plásmido mezclando cinco microgramos del plásmido LENTR lentiviral con tres microlitros de BsmB1 tres microlitros de fosfatasa alcalina seis microlitros de tampón de digestión 10x y 0,6 microlitros de 100 milivolarios recién preparados de TDT.
Lleve el volumen total a 60 microlitros de agua doble destilada e incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos para digerir y desforsforlazar el plásmido. A continuación, el gel purifica el plásmido digerido en el plásmido del lazo y el agua doble destilada. A continuación, prepare las reacciones de recocido para los pares de ARN guía.
Combine un microlitro de cada ARN guía a 100 micromolares con un microlitro de 10x T4 buffer 6.5 microlitros de agua destilada doble y 0,5 microlitros de T4 PNK para un volumen de reacción total de 10 microlitros. Para recocido los pares de ARN guía a sus secuencias de destino incuban las mezclas a 37 grados centígrados a los 30 minutos seguidos de una incubación a 95 grados centígrados durante 5 minutos y luego reducen gradualmente la temperatura a 25 grados centígrados disminuyendo en cinco grados centígrados por minuto. A continuación, diluir los ARN guía recocidos en uno a doscientos en agua doble destilada.
Ahora, prepara las dos reacciones de ligadura. Mezclar un microlitro del plásmido digerido con 0,5 microlitros de una guía perivaneal diluida RNAse 2,5 microlitros de 2x ligadura amortiguan un microlitro de agua doble destilada y 0,5 microlitros de ligasa. Incubar las reacciones a temperatura ambiente durante 10 minutos para ligar el plásmido digerido BsmB1.
A continuación, transformar el plásmido recién ligado en tres bacterias estables y amplificar las bacterias utilizando cualquier método de preparación de plásmido. En una placa de seis pozos, por pozo, semilla 750, 000 2n3 Tcells en DMEM con 10%FBS y 1%pen strep. Use un pozo para cada construcción e incubar las células durante 24 horas.
Al día siguiente, cambie el medio a antibiótico fresco libre-DMEM con 10%FBS. Justo después de cambiar el medio para cada pozo de células chapadas preparar un tubo de mezcla de producción de Lentivirus. Por cada reacción, diluir 11 microlitros de reactivo de transfección de base lipídica con 150 microlitros del medio Opti-MEM para cada reacción.
Luego, en tubos separados, prepare el ADN. Combine dos microgramos del plásmido vectorial lentiviral CLOud9 con dos microgramos de los otros componentes de embalaje lentiviral. Diluir esta mezcla en 150 microlitros del medio Opti-MEM.
A continuación, combine volúmenes iguales de la mezcla de plásmido lentiviral diluido en el reactivo de transfección diluido a base de lípidos e incubar las mezclas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego a cada pocólo de células añadir un tubo de las mezclas preparadas y continuar la incubación. 48 horas más tarde, transfiera los medios de producción virales de los pozos de la placa a los cónicos y gítelos a 300 g durante cinco minutos.
A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos frescos para desechar los desechos peletados. Ahora, utilice inmediatamente los medios de producción virales para transducir las células objetivo o congelarlas a 80 grados centígrados para su uso futuro. Comience con la adición de 250 microlitros de cada construcción viral de interés, que en este caso, se compone de plásmidos CLOud9 complementarios a un tubo cónico de 50 mililitros que contiene 80.000 células.
A continuación, agregue suficiente polybrene para que esté entre uno y ocho microgramos por mililitro en solución. A continuación, ajuste el volumen total de cada tubo a un mililitro utilizando medios libres de antibióticos. Ahora para aumentar el contacto entre las partículas del virus y las células giran las células a 800 g durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego vuelva a suspender las celdas en el sobrenadante por pipeteo. A continuación, cargue la suspensión de las células sobre las placas de cultivo e i incubarlas durante 24 horas. Al día siguiente, recoja las células.
Centrifugarlos a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y volver a suspenderlos en medio normal. Al día siguiente, añadir puromicina e higromicina al medio para seleccionar para las células doblemente transducidas. La concentración adecuada de antibióticos debe determinarse con antelación para cada tipo de célula.
Luego, incubar las células en el medio de selección durante al menos tres días antes de proceder con las aplicaciones posteriores y continuar manteniendo las celdas y los medios de selección. Para dimerizar las células seleccionadas y transducidas CLOud9 añaden un ABA mililolar al plato de cultivo. Para los controles, agregue DMSO y, a continuación, mantenga las celdas con ABA o DMSO durante el experimento.
Para invertir la dimerización, lave las células con suficiente PBS para cubrir la superficie de la placa dos veces. A partir de entonces, las células de cultivo en medios libres de ABA para mantenerlas en un estado no dimerizado. El uso adecuado del sistema CLOud9 induce el contacto reversible de las construcciones complementarias CSA y CSP CLOud9 mediante la adición o eliminación de ABA a medios de cultivo celular.
Las construcciones CSA y CSP se localizan en regiones genómicas apropiadas utilizando la guía estándar DE CRISPR RNAse. Se utilizó la inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR cuantitativa para garantizar la localización precisa en la focalización de cada componente CLOud9. Además coimmunoprecipation con y sin ABA verificado CSA y cetirización CSP en presencia del ligando, así como la reversibilidad en ausencia del ligando.
Después de la dimerización de la ABA, se midió un mayor contacto entre la betaglobina y la LCR mediante la captura de confirmación del cromosoma. Sin embargo, esto no se observó en los controles que contienen sólo la CSA o sólo la construcción CSP. La creación de la interacción beta-globina de LCR no eliminó por completo el contacto endógeno de la globina LCR.
Solo se añadió al contacto original. El aumento de los contactos LCR de beta-globina se observó a través de 72 horas de dimerización, independientemente de la región exacta dentro de la LCR objetivo o de la región promotora de la beta-globina. Por último, la reversibilidad del sistema se confirmó con la captura de confirmación del cromosoma después de eliminar ABA.
Esto dio lugar a la renovación completa de la confirmación endógena. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cambiar los medios y agregar células transducidas CLOud9 frescas todos los días. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso y todas las precauciones utilizadas en BSL 2 siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.
