Name: examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Joshua Singer, Jonathan Schenk, así como revisores pensativos por comentarios en el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Ben White y Harold Zakon debates sobre la técnica. Jonathan Schenk proporciona los datos de la Figura 3A. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Whitehall y un R21 de NIH a QG.

1. preparar moscas y promotor de GAL4 identificar líneas
<ol><li>Seleccione una línea de promotor de GAL4 y cruzar con las moscas con el transgén de UAS-NaChBac y un transgen de optogenetic para la activación. Nota: CsChrimson UAS11 se selecciona debido a su alta conductancia y la facilidad con la cual activa mediada por NaChBac los potenciales de acción. UAS-NaChBac y UAS-CsChrimson están disponibles en el repositorio de las poblaciones de Bloomington.</li>
	<li>Preparar todo-trans retinal como una solución en etanol (35 mM) y guardar la solución en el congelador a-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 μl de este stock en aproximadamente 5 mL de patata rehidratado escamas alimento y añadir esta mezcla a la parte superior de un frasco de medios convencionales de Drosophila .</li>
	<li>Criar moscas adultas expresar csChrimson en alimentos que contienen 0,2 mM all-trans-retinal para 1 – 3 días11.</li>
</ol>2. preparar Stock TTX
<ol><li>Crear una solución stock de 1 mM TTX en agua destilada o desionizada. Almacenar esta solución en un refrigerador de laboratorio durante varios meses. Revise las políticas de las instituciones en relación con el almacenamiento de TTX como muchas instituciones clasifican TTX como una sustancia peligrosa o controlada.</li>
</ol>3. preparar moscas para electrofisiología
<ol><li>Recoger 1 – 3 días adulto viejo vuela que sobresalen en la comida con todo-trans-retinal. Nota: Consulte Murthy y Turner en 2013 para una descripción detallada del parche sujeción Drosophila las neuronas12,13.</li>
	<li>Poner las moscas en un vial de centelleo de vidrio. Coloque el frasco en hielo durante 1 minuto inmovilizar a las moscas.</li>
	<li>Utilizar pinzas gruesas para insertar una mosca en una cámara de grabación a medida. La cámara consta de un 3 ½" círculo corte láser de acrílico de 1/16". Corte un agujero de ¾" está en el centro donde se une una hoja personalizada con epoxy en 2 partes. La hoja contiene un triangular en forma de esperanza de que la mosca se le introduce.</li>
	<li>Aplique cera o epoxi curable UV alrededor del animal para fijarla firmemente dentro de la cámara de grabación.</li>
	<li>Iluminar la preparación con un cuello de cisne de fibra óptica para visualización bajo un estereomicroscopio. Fijar las fibras de cuello de cisne para la iluminación oblicua ajustando para que iluminan la marcha directamente desde el lado.</li>
	<li>Ajustar el nivel de luz a la posición más baja posible que todavía permite la clara visualización de la mosca. Esta intensidad de la luz variará a través de experimentos individuales. Nota: Este protocolo puede ser adaptado mediante el uso de un in situ cerebro explante método14.</li>
	<li>Recuperar la solución salina de grabación externos. La solución salina contiene en mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfónico, trehalosa 8, glucosa 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2y 4 de MgCl2 (ajustado a mΩ 270 – 275). La solución salina es burbujeada con 95% O25% CO2 (carbogen) y cuenta con un pH ajustado a 7.315.</li>
	<li>Coloque 4-6 gotas de solución salina de grabación extracelular sobre la preparación de la mosca. En este punto, aumentar el nivel de luz en el microscopio de disección para una mejor visibilidad.</li>
	<li>Afilar un alambre de tungsteno mediante electrólisis. Para hacer el cable, preparar una solución saturada de KNO3 y aplicar aproximadamente 20 V de CA corriente sumergir la punta del alambre en la solución 20 veces para 100 ms hasta que la punta es afilada. Use el alambre de tungsteno afilada para quitar la cutícula sobre la cabeza de la mosca y exponiendo el cerebro.</li>
	<li>Además exponer el cerebro quitando tráquea y cuerpos grasos que lo rodean. Si acceder a los lóbulos antenales, use un alambre de tungsteno doblado o una herramienta similar a meter suavemente antenas por debajo de la hoja de grabación cámara para aumentar la visibilidad. Utilice pinzas afiladas para rasgar suavemente lejos el revestimiento glial que cubre el área de interés donde se harán grabaciones.</li>
	<li>Transferencia de la cámara de grabación a la plataforma de electrofisiología. Inmediatamente iniciar la perfusión con solución salina de grabación externo burbujas con carbogen para preservar el cerebro. El depósito de solución salina se coloca sobre la platina del microscopio y es gravedad-alimentó a la preparación. Utilice una línea de vacío y un matraz de Erlenmeyer de 2 L para recoger los residuos salinos.</li>
</ol>4. obtener el registro de celulares
<ol><li>Tire un extractor comercial pipeta pipetas de parche. Consulte el manual de configuración conseguir una pipeta adecuada con una resistencia de punta cerca de mΩ 7.</li>
	<li>Añadir 4 μL de solución de grabación interno en una pipeta de parche. La solución salina interna consta de aspartato de potasio 140, 10 HEPES, MgATP 4, Na 0,53GTP, 1 EGTA y 1 KCl en mM.</li>
	<li>Configurar el amplificador de abrazadera de parche para registro de celulares. Cero offset del amplificador y el amplificador para entregar pulsos de prueba. Aquí, se utiliza un amplificador de abrazadera AM sistemas parche 2.400.</li>
	<li>Aplicar presión positiva a través de la pipeta y acercarse a la célula. Uso de un micromanipulador para dirigir la pipeta y en contacto con la célula. Libere la presión positiva. Conjunto del explotación potencial de la membrana a -60 mV. La pipeta debe formar un sello gigaohm con membrana de la célula según lo evidenciado por una sub-picoamp bajo tenencia actual. Nota: Si usando GFP celular objetivo, intentar minimizar el uso de la luz epifluorescente para evitar activación de ChR2 y potencial depresión sináptica. También espere unos minutos antes de aplicar el paso 5.</li>
	<li>El amplificador para entregar pulsos de prueba de -50 mV a -60 mV. Esta opción es estándar en los amplificadores de la abrazadera del remiendo. Pulsos de prueba revelará un gran capacitativa transitorio que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta patch. Eliminar transitorios capacitativa ajustando las perillas de la compensación de capacidad en el AM 2400 o similar amplificador.</li>
	<li>Se aplican breves impulsos de presión negativa para romper la membrana celular y obtener configuración de celulares. Nota: Una configuración de células enteras se observa cuando hay un gran aumento en los transitorios capacitativa mostrando la capacitancia de la neurona. Un pequeño aumento en la explotación actual (línea base) es probable que también se observará. El amplificador a modo de pinza y ajuste potencial de la célula de -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. probar la conectividad sináptica
<ol><li>Configurar el sistema de adquisición (DAQ) de datos para activar un controlador LED para generar pulsos de luz. Aquí, se utiliza un sistema DAQ instrumentos nacionales con Matlab para entregar una señal analógica a un conductor del LED. La intensidad del LED se ajusta a través de la señal analógica al conductor. El LED es 620-630 nm longitud de onda LED.</li>
	<li>Coloque el LED rojo alta potencia directamente debajo de la preparación. Ajustar la intensidad de luz para que la mosca llegue a 0.238 mW/mm2 .</li>
	<li>Activar las neuronas presinápticas durante la grabación de la célula postsináptica de interés. Lograr optogenetically de activación de la célula, pharmacogentically, o a través de la estimulación nerviosa. Aquí, se aplican csChrimson y pulsos breves de luz roja. Nota: Las conexiones sinápticas pueden ser monitoreadas en pinza como EPSPs o abrazadera del voltaje como EPSCs. Una conexión sináptica debe ser visible antes de aplicar la TTX en respuesta a un pulso de luz de 40 ms. Si no se observa ninguna conexión, no es probable que las neuronas synaptically están conectados ya sea mono - o polysynaptically. La explotación potencial puede ajustarse para enfatizar las conexiones excitatorias o inhibitorias en consecuencia.</li>
	<li>Si una conexión se observa en solución salina normal, añadir TTX al sistema de perfusión para lograr una concentración final de 1 μm. Utilice una bomba de recirculación para capturar y reutilizar la solución salina para conservar la TTX. La bomba peristáltica se dibuja la solución salina del baño y volver al depósito de solución salino.</li>
	<li>Ajustar la velocidad de la bomba para proporcionar un fuerte vacío constante que no permite ese nivel salino en el baño al subir y bajar. Nota: La aplicación de TTX dará lugar a la cesación de clavar la actividad en la neurona que se está controlando en célula entera. Esto confirma que suficiente TTX ha sido añadido a la solución salina.</li>
	<li>Volver a aplicar pulsos breves de luz roja (40 ms para cada pulso). En este punto, es probable que cualquier conexión sináptica que permanece monosynaptic. Añadir a antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculación para probar la naturaleza química de las conexiones sinápticas que permanecen en la TTX. Nota: Cuando se combinan optogenetics y focalización fluorescente de neuronas, puede ser importante no activar persistentemente la población presináptica de las neuronas, tratando de obtener una grabación. Esto puede conducir a la depresión sináptica y hace difícil ver las conexiones. Porque csChrimson tiene una banda de excitación larga que se extiende ampliamente en la gama de la proteína verde fluorescente, un fluoróforo rojo puede utilizarse para visualizar neuronas y channel2rhodopsin (Ch2R) puede utilizarse para excitar a las poblaciones de la célula. Hacerlo requiere genética específica y un cubo de filtro personalizado. Para generar moscas adecuadas, hacer moscas que expresan el fluoróforo rojo (RFP o mCherry) bajo los sistemas de expresión binaria de sistema LexA o Q. Estos tendrán que ser cruzado con moscas expresando un promotor Gal4 y UAS-Ch2R y UAS-NaChBac genes efectores. El cubo de filtro óptimo para epifluorescencia tendrá una gama estrecha de excitación excitar el fluoróforo rojo, pero no excita Ch2R. Además, el sistema de filtro debe incluir un filtro de emisión del pase largo para recoger la mayor cantidad de luz emitida. Se utilizó un filtro personalizado de croma que incluía números de parte et580/25 x y t600lpxr (del conjunto 49306), pero con un filtro de barrera/emisión de et610lp.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Análisis TERPS complementan técnicas actuales utilizadas para circuito agrietarse permitiendo la detección de las sinapsis entre las neuronas identificadas. Específicamente, el enfoque revela conexiones monosynaptic por silenciamiento ampliamente los potenciales de acción con TTX restableciendo la excitabilidad en una población selecta de neuronas con el canal de sodio TTX-insensible NaChBac. Liberación sináptica se produce por el estímulo de optogenetic mientras que eventos postsinápticos son monitoreados con grabaciones de celulares. TERPS se distingue de otros enfoques como el asimiento por ser sensible a granel o transmisión de volumen provocada en largas distancias y la capacidad para realizar manipulaciones farmacológicas. La técnica es relativamente sencilla de utilizar y requiere solamente una grabación electrodo y una fuente de luz para la estimulación de la optogenetic, que es más factible que la obtención de grabaciones de celulares duales en partes pre- y postsinápticos de la sinapsis. Un requisito básico de la TERPS es que los potenciales de acción son fácilmente bloqueados por TTX en el sistema en estudio. Pero, como TTX actúa sobre las neuronas a través de una amplia gama de filos taxonómicos, es probable que TERPS podría aplicarse ampliamente a ambos sistemas modelo mamíferos e invertebrados.
TERPS fácilmente modificable en un número de maneras para facilitar tanto la estimulación de la supuesta población presináptica o para la grabación de dianas postsinápticas. Aquí, se utiliza una herramienta de optogenetic para estimular las poblaciones objetivo, aunque es posible la activación de una variedad de mecanismos. Estímulo del nervio de axones sensoriales, por ejemplo, es habitual en estudios de la transmisión del nervio antenal en Drosophila16 y es conveniente en otros sistemas sensoriales, incluyendo los nervios periféricos que contiene mechanosensory neuronas. Un enfoque similar a las pruebas de conectividad funcional en Drosophila expresó GCaMP indicadores de calcio en una población de neuronas durante la conducción de actividad en otra población a través de los ionotrópicos purinoceptor P2X2 y ATP aplicación2. Este enfoque debe ser compatible con TERPS manifestando simplemente Co el transgén de NaChBac con los receptores P2X2 en una neurona y GCaMP en otra población para un método totalmente libre de parche. Sin embargo, se debe tener precaución con los enfoques provocando despolarizaciones más lento, como los receptores diseñador muscarínicos basado exclusivamente activados por una droga de diseño (DREADDs)17,18. Despolarización lenta podría llevar a la inactivación de NaChBac antes de la generación del potencial de acción.
Se han empleado métodos similares para TERPS en sistemas mamíferos. Estas técnicas combinan TTX y channelrhodopsin trazar conectividad entre las neuronas. Channelrhodopsin activación solo generalmente no despolarizar las neuronas suficientemente, y así se aplica el bloqueador de canal potasio 4-AP con TTX para obtener la liberación de19,20,21. Mientras que funciona en muchas sinapsis, puede que no funcione en algunas sinapsis metabotrópicos si el destino corriente abajo del receptor es un canal de potasio sensible 4-AP. Por ejemplo, serotoninérgico modulación de la respuesta olfativa en polillas se basa directamente en la modulación de tal un 4-AP sensible K+ corriente (IA)22. También este enfoque no ha funcionado en la CSDn a sinapsis LN (datos no mostrados). Así, TERPS tiene una ventaja de que requiere menos intervención farmacológica respecto a otros métodos comúnmente usados y pueden trabajar en el rango más amplio o sinapsis.
Hay algunas limitaciones a los TERPS que deben ser considerados. En primer lugar, puede haber efectos secundarios potenciales de expresión crónica del canal de NaChBac en todo el desarrollo. Función y montaje de circuito apropiado pueden confirmarse mediante la comparación de la actividad de las neuronas entre control vuela falta la construcción de NaChBac y vuela con la construcción en ausencia de TTX. Para evitar estos problemas, expresión del transgén NaChBac podría controlarse temporal mediante expresión del represor termosensible de GAL4, GAL8023. Además, si una sinapsis sólo se observa en una forma dependiente de estado, es concebible que la supresión de la actividad de la red con TTX podría ocultar tal conexión. Es importante destacar que una conexión positiva observada con TERPS probablemente representa una verdadera conexión mono sinápticos, mientras que un resultado negativo no es prueba de la ausencia de una conexión.
TERPS puede revelar la capacidad del transmisor liberan de una neurona para afectar a postsynaptic socio claramente, la dinámica de canal lento de la NaChBac y el potencial de meseta asociado con su activación hacerla menos aplicables al estudio de los clásicos neurotransmisión. Un método para alterar TERPS para más rápido, más natural liberación de transmisor será expresar una versión modificada de la TTX-insensible de la endógena Drosophila sodio canal para NaChBac. Esta alteración sería causar actividad naturalista clavaba en la célula presináptica y permiten análisis más convencional de la transmisión sináptica en la ausencia de actividad de la red. Esto tendría grandes posibilidades para estudios de codificación tipo de sinapsis, que suscitar una amplia gama de la actividad presináptica sin reclutar redes polysynaptic sería deseable.

Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad3. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.
Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio++ y Ca++. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada4,5. Determinar la proporción exacta de Mg++ ++ de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación6. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic 7. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa8. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación9 o GABAérgicas inhibición10.
Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic9. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Used as a neural activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores excitibility in cells in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Require co-factor for channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 Stainless Steel&amp;nbsp;Sheet,&amp;nbsp;0.002&quot;&amp;nbsp;Thick,&amp;nbsp;10&quot;&amp;nbsp;Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Used for dissection of preparation</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Used during dissection to secure fly in foil</td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Used with waxer</td></tr><tr><td>Number 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Used for dissection and desheathing</td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Used to remove parts of the cuticle during dissection</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td></tr><tr><td>Reciculating Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>for recirculating TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller for peristaltic pump</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&amp;nbsp;Precision Compressed Air Regulator</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>For applying positive pressure during patching</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>For patch pipettes</td></tr><tr><td>Multipurpose Gauge</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Gauge for pressure regulator</td></tr><tr><td>Electrophysiology Camera</td><td>Dage MTI&amp;nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M850F2</td><td>For oblique illumination</td></tr><tr><td>fiber optic for IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couples to IR LED</td></tr><tr><td>Objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>For visualizing RFP and mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>&lt;strong&gt;M470L3&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;</td><td>For visualizing GFP</td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma</td><td>&lt;strong&gt;49011&lt;/strong&gt;</td><td>For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&amp;nbsp;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td><td>Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic to combine Amber and blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td></tr><tr><td>Red LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Used to drive csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Used to position pipette during recordings</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>An equivalent amplifier is suitable</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td></tr><tr><td>Data Acquisition System&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 781044-01</td><td>Used to record data from amplifier to computer</td></tr><tr><td>Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Used to connect amplifier to DAQ card.</td></tr><tr><td>Steel Foil&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Steel foil for custom recording chamber</td></tr><tr><td>Magnets</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>To secure recording chamber to ring stand</td></tr><tr><td>1/16&quot; Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr></tbody></table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Aquí, se aplica una nueva técnica denominada Tetrotoxin (TTX) resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS) para probar conexiones monosynaptic entre neuronas de destino. El método se basa en la expresión de un activador de transgénico con el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac, en la neurona presináptica específico. Conexiones con supuestos socios postsinápticos dependen de grabaciones de celulares en presencia de TTX, que bloquea la actividad eléctrica de las neuronas que no expresan NaChBac. Este enfoque puede ser modificado para trabajar con cualquier activador o proyección de imagen de calcio como un reportero de conexiones. TERPS agrega al conjunto creciente de herramientas disponibles para determinar la conectividad en redes. Sin embargo, los TERPS es único en que confiablemente también divulga a granel o transmisión de volumen y derrame transmisión.

TERPS se utiliza para distinguir entre mono - y polysynaptic en conexiones sinápticas entre las neuronas. Mientras que una estimulación débil de una célula puede utilizarse para probar las conexiones directas, conduciendo a una mayor actividad presináptica a menudo reclutas polysynaptic conexiones (figura 1A). TERPS funciona Co expresando el canal de sodio TTX-insensible NaChBac y un activador de optogenetic y pruebas de conexiones en presencia de TTX para eliminar conexiones polysynaptic (figura 1B). TTX bloquea eficazmente los potenciales de acción en el cerebro de la Drosophila , lo que es una preparación adecuada para TERPS (figura 2A). Expresión transgénica del canal de sodio NaChBac rescata la excitabilidad en las neuronas y los resultados en un potencial gran plateau (figura 2B).
Interneuronas locales (LN) en el lóbulo antenal muestran sólidas respuestas al estímulo olfativo (Figura 3A). Sin embargo, porque EPSPs individuales no son fácilmente resueltas en el soma de la LN, no queda claro si estas respuestas surgen directamente de la entrada de la neurona olfativa del receptor (ORN) o indirectamente la entrada a través de las neuronas de proyección (PN) (figura 3B). Utilizando TERPS, ORNs se muestra aquí, de hecho hacen conexiones sinápticas directas con LNs (figura 3).
Una característica única de la TERPS es su capacidad para resolver específicamente la transmisión de volumen extra sináptica que puede ocurrir con GABA o neuromoduladores como la serotonina. Estimulación de una neurona serotonergic (CSDn) en el lóbulo antenal de Drosophila resulta en una mezcla de excitación y la inhibición de una interneurona local (Figura 4A y Figura 4B). La excitación es meditada por la acetilcolina transmisor excitatorio y la inhibición es causada por serotonina (figura 4 y figura 4). TERPS puede utilizarse para determinar si las conexiones monosynaptic eliminando conexiones polysynaptic (figura 4E). En TTX, una fuerte inhibición se observa todavía en el LN, sugiriendo que llega desde directamente en la activación de una neurona serotonergic específica (figura 4F y figura 4). Esta conexión está bloqueada por la metisergida antagonista de serotonina. La sinapsis excitatoria mediada por acetilcolina fue eliminada en TTX, sugiriendo que se presentó de polysynaptic fuentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig1.jpg"> Figura 1 : TERPS elimina conexiones polysynaptic y aísla entradas monosynaptic. (A). un diagrama esquemático que muestra que el aumento de la actividad presináptica puede reclutar polysynaptic conexiones. (B). un diagrama que ilustra cómo TERPS puede quitar polysynaptic contribuciones mediante TTX para eliminar actividad clavaba en las neuronas. La excitabilidad se restablece exclusivamente en una población de neuronas que puede ser excitado optogenetically. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig2.jpg"> Figura 2 : NaChBac restaura la excitabilidad neuronal en Drosophila neuronas. (A) la aplicación de 1 μm que TTX suprime clavar en las neuronas de la Drosophila . La actividad espontánea y evocada por el olor de la inhibición se eliminarán TTX. (B) NaChBac y csChrimson se expresan en la CSDn y el cerebro se expone a la TTX. csChrimson estimulación despolarizan la CSDn y después se cruza un umbral, hay gran aumento en el voltaje de la membrana de la CSDn no lineal. Esta despolarización rápida constituye un potencial de meseta-como (recuadro). Cada color a través de intensidades de la simulación se corresponde con el mismo color en el margen de tensión. Esta figura ha sido modificada de Zhang y Gaudry 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig3.jpg"> Figura 3 : TERPS revela conexiones monosynaptic entre ORNs y LNs. Grabación de muestra (A) A que muestran una respuesta de olor en un LN. Esta respuesta puede ser mono o polysynaptic en la naturaleza. TERPS (B) puede ser probado en la ORN a sinapsis LN. TTX se utiliza para bloquear los potenciales de acción y excitabilidad en todas las células en la preparación. Excitabilidad es restaurada exclusivamente en las ORNs vía el canal de sodio NaChBac. Las ORNs entonces pueden ser excitadas con channelrhodopsin para obtener la liberación sináptica. Eventos sinápticos se miden postsinápticamente usando grabaciones de celulares. (C) TERPS revela que la ORN a sinapsis LN es monosynaptic. TERPS puede combinarse también con farmacología para mostrar que la sinapsis colinérgica y bloqueado por el receptor nicotínico antagonista mecamilamina (200 μm). La barra vertical gris indica el momento de la estimulación de la ORN. Esta cifra ha sido modificada de Zhang y Gaudry en 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57052/57052fig4.jpg"> Figura 4 : TERPS es sensible al volumen o a granel transmisión liberación de moduladores neuronas. (A) la estimulación de los resultados de la CSDn en un potencial de acción de un LN registrada en el lóbulo antenal de Drosophila . (B) el LN es hyperpolarized para que CSDn estimulación resulta en una actividad subliminal. La respuesta de LN consiste en una rápida despolarización seguida de una hiperpolarización más lento. La barra gris denota el momento de la estimulación de la CSDn. Metisergida (50 μm), un antagonista de receptor 5-HT amplio, bloquea la hiperpolarización lenta pero no tiene efecto sobre la despolarización. Mecamilamina bloquea la despolarización rápida, sugiriendo que es colinérgica en la naturaleza. TERPS (C) puede utilizarse para resolver los componentes químicos de la CSDn a sinapsis LN son mono-versus polysynaptic. (D) la CSDn es estimulada en presencia de TTX y postsinápticas respuestas LN se miden en grabaciones de celulares. La hiperpolarización persiste en TTX es monosynaptic en la naturaleza. Esta hiperpolarización también es bloqueado por la metisergida, consistente con la transmisión serotonergic. La despolarización breve que sigue TTX probablemente es mediada por brecha eléctrica enganche, como no bloqueados por antagonistas nicotínicos. Esta cifra ha sido modificada de Zhang y Gaudry en 20169. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/57052fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: hoja de Drosophila. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/DrosophilaFoil.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: fisiología cámara. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57052/PhysiologyChamber.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K vistas.  University of Maryland. Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Investigación

Neurociencias

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biología

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Biología del Desarrollo

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Visualización de redes de microtúbulos en uniones neuromusculares y células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor destacado: Comprensión de la red de microtúbulos en las uniones neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

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