Nos gustaría agradecer a Manuel Zimmer por facilitarnos el archivo de diseño inicial que fue adaptado para el uso con los varones; Frank Schroeder para la síntesis y de ascr #3; Ross Lagoy para el insight y la asistencia con la proyección de imagen y análisis; y Laura Aurilio para la fabricación principal y que, junto a Christopher Chute, contribuyó a la revisión de este manuscrito. Fondos para este trabajo se prestó bajo la subvención de institutos nacionales de salud 1R01DC016058-01 (J.S.), la concesión del National Science Foundation CBET 1605679 (D.R.A.) y la Burroughs Wellcome carrera premio en interfaz científica (D.R.A.).

1. fabricación de dispositivo Nota: ver referencia 1.
 Nota: el silicio moldea maestro fueron fabricado usando las técnicas estándar photolithographic para patrones photoresist SU-8 con un silicio principal 1 , 7. Patrones de dibujos de la oblea se imprimieron 25.000 ppp. El hombre adaptado de dispositivo un Chip olfativa Chronis diseño 19 con un cambio en el gusano puerto de cargamento, adaptando un diseño de M. Zimmer (correspondencia personal, 2016). Una vuelta se incluye para controlar la rotación de los animales. La anchura del gusano canal Puerto de carga es reducida a 50 μm. Todos los canales son 32 μm de altura. Una vez que un molde principal del silicio es disponible para el usuario, el usuario puede seguir el posterior protocolo, como se describió anteriormente 1.
<ol><li>Agente de base y curado de mezcla PDMS en una proporción 10:1 en peso.</li>
	<li>Homogeneizar con pipetas de transferencia.</li>
	<li>Desgasificar la mezcla en un desecador de vacío de 1 h, hasta quitan todas las burbujas visibles.</li>
	<li>Vierta la mezcla en un maestro del molde de silicio en un plato de 150 mm de diámetro hasta 5 mm de espesor (100 g). Utilice una pipeta Pasteur para eliminar burbujas o polvo que se han introducido a la mezcla de.</li>
	<li>Hornear a 65 ° C durante al menos 3 horas o durante la noche.</li>
	<li>Cortar el PDMS del molde con un bisturí y cortan los dispositivos separados utilizando una hoja de afeitar.</li>
	<li>Perforar los orificios de entrada y salida con un sacador cutáneo de 1 mm.</li>
	<li>Limpie los orificios con dH 2 O, etanol y otra vez con dH 2 O para quitar las partículas de los golpes. Secar el dispositivo en un pulso de corriente de aire.</li>
	<li>Limpiar ambos lados de la canal y la parte superior del aparato con cinta adhesiva, quitar cualquier polvo o residuo restante en el dispositivo para permitir la vinculación exitosa.</li>
	<li>Plasma-bond el dispositivo, canal hacia abajo, a un vaso de tapa no. 1.
	Vidrio de cubierta <ol><li>exponer y dispositivo (canal hacia arriba) al plasma de aire mediante condiciones que permitan la vinculación apropiada, por ejemplo de 100 W durante 30 s o 24 W en 60 s. 
		Nota: Configuración se puede ajustar para mejorar la eficiencia de la Unión. Las condiciones de vinculación de plasma no son tan críticas como la limpieza apropiada al tratar de mejorar la eficiencia de la Unión. No se adherirá un dispositivo lo suficientemente limpio, incluso en condiciones de plasma ideal.</li>
		<li>Invertir el vidrio de cubierta en el lado del canal del dispositivo y presione hacia abajo con el pulgar durante 5 s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparación de buffer <ol><li>diluido 1 x S basales (100 mM NaCl y 0.05 M KPO 4, pH 6.0) de una bolsa estéril de 10 x.</li>
	<li>Diluir 1 M tetramisole stock a una concentración final de 1 mM de 1 x S basales para todos tampón soluciones.</li>
	<li>Añadir fluoresceína a ambos el &#34; control de flujo &#34; y &#34; buffer &#34; embalses.
	<ol><li>Crear un stock de 100 mg/mL de fluoresceína en 1 x S basales.</li>
		<li>Diluir la acción a concentraciones finales de 1 μg/mL en el control de flujo y 0,1 μg/mL en el búfer de.</li>
	</ol></li> <li>Crear los estímulos.
	<ol><li>Glicerol diluido a una concentración final de 1 M en 1 S basales de X.</li>
		<li>Diluido ascaroside #3 (ascr #3) a una concentración final de 1 μm en 1 X S basales.</li>
	</ol></li></ol> 3. Configuración de dispositivo Nota: ver 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> figura 1. Instalación de dispositivos microfluídicos. (A) reservorios y la tubería. Jeringa de 30 mL sin un émbolo sirve como el &#34; embalse. &#34; esto está conectado a una válvula Luer con tres opciones de flujo. Un enchufe está conectado a una jeringa de 3 mL con un émbolo, mientras que el otro está conectado a una aguja (naranja) que se inserta en la tubería que se conecta al dispositivo de microfluidos. (B) el total configuración de los microfluidos experimento de la proyección de imagen. El dispositivo se coloca en un escenario de un microscopio de epifluorescencia invertida, por encima de las lentes del objetivo. El &#34; control de flujo &#34; buffer viaja a través de una válvula de 3 vías que está controlada por una unidad en el estante encima de la configuración. Líneas que contienen tampones se insertan luego en los puertos de dispositivo apropiado. (C) los puertos del dispositivo microfluídico. El &#34; control de flujo &#34; puertos flanquean los otros puertos de entrada: el &#34; estímulo &#34; y &#34; buffer &#34; puertos. El &#34; toma &#34; puerto es el puerto de la derecha. Debido a la ubicación de la arena de carga del gusano, el &#34; gusano de carga &#34; puerto es el puerto más central en el dispositivo. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Prepare tres embalses líquidos conectando una jeringa de 30 o 60 mL para válvula de 3 vías Luer, con una jeringa de 3 mL y aguja conectada a la válvula Luer así (como en la figura 1A). Conectar la aguja al tubo que se extiende hasta el dispositivo de microfluidos (como en la figura 1A -B).</li>
	<li>Sacar las burbujas de aire del depósito y tubería.</li>
	<li>Llene la jeringa de 3 mL con tubo conectado con 1 x S basales e insertarla en la salida de Puerto</li>
	<li>Suavemente aplique presión en la jeringa hasta que el buffer aparece en la parte superior de los orificios de entrada.</li>
	<li>Conectar el control de flujo, buffer y tubería de estímulo a los orificios de entrada apropiado (como en la figura 1B -C), asegurando que las gotas de líquido están presentes en el puerto de carga orificio y el tubo de búfer que se unirá.</li>
	<li>Otra vez, suavemente aplique presión sobre la jeringa que está conectada al puerto de salida hasta que aparezcan gotitas en el gusano carga entrada puerto.</li>
	<li>Inserte un perno de bloqueo sólido en el gusano que se carga del puerto</li>
	<li>Retire el orificio de salida de la jeringa y conectar la línea de salida conectada a la aspiradora de casa (-670 Torres).</li>
	<li>Inspeccione el dispositivo para las burbujas en el flujo de los canales, visualmente y mediante video confirmación a través de un software compatible con la cámara utilizada, como el software de la abrir-fuente Micro-Manger. Vea el paso 6 para consejos sobre el uso de Micro-Director.
	<ol><li>Si hay burbujas, esperar a que desaloje o sean absorbidas por el PDMS de pared antes de introducir cualquier animal, la presencia de burbujas alterará el flujo adecuado de líquidos a través del dispositivo.</li>
	</ol></li> <li>Usando un filtro GFP, confirmar la dinámica de flujo apropiado dentro del dispositivo antes de gusano carga accionando la válvula de 3 vías y observando el cambio de amortiguadores.
	<ol><li>Determine la dinámica de flujo adecuado: observar la fluoresceína presente en las soluciones tampón y control de flujo ( Figura 2D -2E) cuando se cambia el valor de control de flujo pulsando el control botón correspondiente a la válvula de 3 vías en el enlace de la válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Después de abrir el Micro-Manager, haga clic en &#34; Live &#34; para observar una imagen en vivo del dispositivo. Encienda la fuente de luz fluorescente para observar el flujo de búferes en el dispositivo ( Figura 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Figura 2: Un chip olfativa microfluídicos adaptados al hombre. (A) el flujo de los patrones del dispositivo cuando el gusano se expone al buffer. Tampón (B) se muestra en color marrón, y control de flujo (FC) se muestra en amarillo, con el estímulo (S) en blanco. El gusano puerto de cargamento ha sido adaptado para incluir una curva, que permite mejor control de la orientación de gusano. (B) el flujo de los patrones del dispositivo cuando el gusano está expuesto a los estímulos. Tampón (B) se muestra en color marrón, y control de flujo (FC) se muestra en amarillo, con el estímulo (S) en blanco. (C) mediciones del dispositivo adaptada como fabricados. El gusano puerto de carga termina en una 42 μm de apertura, con un canal de μm 50 diseñado para el hombre ancho. La altura de los canales es 32 μm, a pesar de un objetivo de 25 μm en el diseño. (D-E) A atrapado hombre expresando p sra-6:: GCaMP3. El promotor de la sra-6 no es específica de la ceniza, y alguna expresión puede observarse en la neurona ASI, aunque no hay oscilaciones de calcio fueron observados en ASI. La imagen es (D) una combinación de la iluminación de campo claro y fluorescente, mientras que (E) sólo es fluorescente. Las barras de escala denotan 42 μm. (F) ceniza la neurona responde a la estimulación de glicerol de 1 M con fuerte actividad de los nervios. El área azul indica el tiempo del estímulo de 1 M glicerol. La región sombreada denota el error estándar, n = 20 pulsos de siete gusanos. Los rastros rojos denotan las respuestas despolarizantes. Los ejes muestran ΔF/F 0. La barra de escala indica 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 4. preparación de animal Nota: ver referencia 23.
<ol><li>Las respuestas de la ceniza de la proyección de imagen a glicerol de 1 M.
	<ol><li>Lugar aproximadamente 20 C. elegans machos que son positivos para p sra-6:: expresión de matriz GCaMP3 sobre una placa de agar de nematodos crecimiento medio (NGM) sembrado con césped de OP50 e. coli. Utilice un marcador de la inyección o las expresiones del GECI fluorescente para la identificación de animales positivos matriz. 
		Nota: Animales positivos matriz se fluorescencia según el GECI utilizado (es decir, animales expresando GCaMP se fluorescencia verde bajo el estímulo de la luz azul, mientras que RCaMP animales fluorescencia roja bajo el estímulo de luz verde). Marcadores de coinyección pueden extenderse de otras proteínas fluorescentes GFP y RFP, a marcadores fenotípicos, como rol-6, o rescatar un fenotipo dominante, tales como la mutación de pha-1 28.
		<ol><li>Si recogiendo inmediatamente antes del ensayo, selección de machos jóvenes. Si escoger el día antes del ensayo, selección varones larvas L4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Las respuestas de la CEM a 1 μm ascr #3 la proyección de imagen.
	<ol><li>Pick L4 C. elegans aproximadamente 20 machos (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); lo-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) que son positivos para la expresión de marcadores de coinyección dsRed. 
		Nota: dsRed expresión dentro de las neuronas de ray de la historia hombre es más fácil de observar y confirmar que la expresión de GCaMP dentro de las cuatro neuronas CEM.</li>
		<li>Aislar estos hombres hermafroditas en una placa de agar NGM sembrado con césped de OP50 e. coli para 5-14 h antes de realizar el experimento de la proyección de imagen. 
		Nota: Los machos no aislados de un mínimo de 5 h no responden conductualmente a ascr #3 y por lo tanto pueden presentar incluso menos oscilaciones de calcio a la ascaroside que observa aquí.</li>
	</ol></li></ol> 5. Carga animal Nota: ver refefence 1.
<ol><li>Elegir un gusano sobre una placa de agar NGM no sembrada utilizando técnicas de mantenimiento estándar gusano.
	<ol><li>Pick gusanos por llameante pico (hecho de alambre de platino aplanado), recogiendo las bacterias a la selección, y &#34; untar &#34; un gusano para recogerlo. Coloque con cuidado el gusano sobre la placa de nuevo, lo que le permite arrastrarse apagado en su propia.</li>
	</ol></li> <li>Añadir aproximadamente 5 mL de 1 x S basales a la placa no sembrada, tal que la placa se inunda.</li>
	<li>Dibujar el gusano dentro de una jeringa de carga (es decir, jeringa de 3 mL con tubería adjunta) que ha sido previamente llenada con 1 x S basales.
	<ol><li>No deje de chupar el gusano solamente en el tubo, no en la jeringa de. 
		Nota: Si el gusano viaja en la jeringa, es casi imposible conseguir nuevamente dentro del tubo.</li>
	</ol></li> <li>Apagar el vacío para detener el flujo girando la válvula Luer de salida.</li>
	<li>Quitar el pasador sólido bloqueo el gusano carga puerto</li>
	<li>Gire la válvula Luer conectada al puerto de salida ( figura 1B), por lo que está ventilando. 
	Nota: Utilice un video en vivo mientras se carga el gusano para confirmar la ubicación y orientación de los animales (pasos 5.8-5.13).</li>
	<li>Introducir el gusano de tubo en el gusano que se carga del puerto de carga</li>
	<li>Suavemente aplique presión en la jeringa hasta que el gusano aparece en el canal de carga.</li>
	<li>Si el gusano comienza a entrar en el canal primero la cola, tirando el émbolo de la jeringa para evitar que el gusano en el canal.</li>
	<li>Interruptor entre aplicación y revertir la presión hasta que la cabeza entra en el canal primero.</li>
	<li>Abierto el vacío girando la válvula de 3 vías Luer conectado al puerto de salida para abrirlo al vacío en lugar de ambiente.</li>
	<li>Presionar manualmente presionando el émbolo de la jeringa para orientar y colocar la cabeza del gusano que se expone al canal de flujo tampón, pero no hasta ahora que la cabeza puede moverse libremente ( figura 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Estímulo y la adquisición de <ol><li>utilizando un software de código abierto microscopia, como Micro-Manager, grabar mediante la captura de imágenes como una pila TIFF a 10 fotogramas/s utilizando excitación de luz azul (470 nm) para 30 s.</li>
	<li>Ajustar la exposición en el menú principal a 100 ms. <ol><li>Open &#34; Acq multi-D. &#34; desde el menú principal del software. Establecer la &#34; número de &#34; a &#34; 300, &#34; y el &#34; intervalo &#34; a &#34; 0. &#34; haga clic en &#34; adquirir! &#34; para adquirir el video.</li>
	</ol></li> <li>Aplicar un pulso de s 10 del estímulo 5 s después de iniciar la adquisición. Ajustar la duración de la aplicación del estímulo como se desee.
	<ol><li>Después de la adquisición de 5 s de video, cambiar la válvula de 3 vías controla el buffer de control de flujo para aplicar el estímulo en el animal sometido a prueba. Haga clic en el botón izquierdo en el enlace de la válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Después de 10 s de exposición del estímulo (este tiempo puede ser ajustado como deseada por el usuario), alteran el flujo de reservas pulsando nuevamente el botón izquierdo en el enlace de la válvula.</li>
	</ol></li> <li>Registros en búfer sólo hasta la ventana del 30-s para permitir que la fluorescencia de GECI volver a base.</li>
	<li>Repetir según lo deseado. Esperar 30 s entre el final de la adquisición y la iniciación de la prueba siguiente.</li>
</ol> 7. Análisis de imágenes <ol><li>abrir la pila TIFF con el software de la abrir-fuente, ImageJ, arrastrando el archivo en la ventana de ImageJ.</li>
	<li>Con el cursor, haga clic en y arrastre para definir la región de interés (ROI) alrededor de la neurona de interés. La región con el soma de la neurona de interés (como en la Figura 3A).</li>
	<li>Trama de la z-pila de la intensidad de la fluorescencia del ROI a través de pilas haciendo clic en abrir-&#62; imagen - &#62; pilas - &#62; parcela z perfil.</li>
	<li>Haga clic en &#34; lista de &#34; en la ventana que se abre. Haga clic en Editar - &#62; Copy para copiar los valores. Pegar los valores en un programa de hoja de cálculo.</li>
	<li>Analizar la fluorescencia de fondo para cada pulso arrastrando el ROI a una región del gusano que no contiene la expresión de GCaMP.</li>
	<li>Realizar a fondo cada impulso restando el valor de fluorescencia de fondo del valor de intensidad de fluorescencia de neuronas.</li>
	<li>Calcular ΔF/F 0 para cada fotograma de cada pulso.
	<ol><li>Calcular F 0 como el valor de la intensidad media del ROI para el primer 1 s de la adquisición (por ejemplo, Marcos 1-10).</li>
		<li>Calcular ΔF/F 0 dividiendo el valor de fondo resta para el marco de interés por el valor calculado de 0 F.</li>
	</ol></li> <li>Repita para cada neurona reflejada y cada pulso estímulo.</li>
	<li>Para las neuronas con perfiles de respuesta coherentes, tales como ceniza, promedio de los pulsos para cada neurona y calcular el SEM (como en la figura 2F).</li>
	<li>Parcela promedio de ΔF/F 0 con SEM en el tiempo para cada neurona. 
	Nota: En este caso, es práctica común incluir heatmaps de las respuestas neuronales individuales de cada ensayo así. En las neuronas que no exhiben cambios consistentes en oscilaciones de calcio sobre la exposición a estímulos a través de estímulos repetidos, o en distintos individuos 23, pueden ser más aplicable a pulso individual rastros (como en figura 4). Ver la discusión para más detalles sobre la determinación de cómo mostrar los datos.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El chip olfativo hombre adaptado incorpora una vuelta en un puerto de carga más estrecho, que permite más control de la orientación y para la eficiente captura de machos de C. elegans. Esto permite la visualización de los miembros derecho e izquierdos de pares bilaterales neuronales, sin necesidad de amontonamiento de z. Esta curva permite una orientación de vertical 100% del tiempo en gusanos donde solamente un par bilateral está dirigido con un marcador fluorescente, como ceniza (Figura 2D-E)29,30. Sin embargo, en las clases neuronales con cuatro neuronas radialmente simétricas, como el CEM, todas las cuatro neuronas son accesibles sólo a un tercio del tiempo. Otro tercio de gusanos probados tienen sólo tres de las cuatro neuronas visibles y el tercio restante, la diferencia sólo distinguible entre los cuerpos celulares dorsales y ventrales, no la asimetría izquierda-derecha (datos no mostrados). El puerto más estrecho se combina con una altura más baja de la canal para evitar la fluctuación del gusano a través del eje z. Este diseño permite la proyección de imagen de los hombres en el futuro los estudios, que, combinado con el creciente conocimiento del conectoma masculino25,31, permitirá una mejor comprensión de la función neural específica de sexo.
El análisis realizado en este protocolo utiliza el software libre ImageJ para medir los cambios en la fluorescencia en la neurona de interés. Con el diseño actual, tetramisole 1 mM en el tampón con eficacia paraliza los gusanos y evita el movimiento de las neuronas se va a examinar. Si el movimiento no es prevenible, o si el usuario desea evitar el uso de un paralítico, scripts más complejos de seguimiento deben estar escritos que la pista las neuronas medida7. Sin embargo, en este protocolo, gusanos masculinos sólo movimiento cuando eran demasiado pequeños para ser efectivamente limitados por el puerto de carga y cuando está presentado con un estímulo extremadamente aversivo, como el glicerol. Incluso en estos casos, el movimiento es breve y no requiere de grandes cantidades de ajustes: ajuste de un retorno de la inversión en la nueva ubicación de neurona alivia la incorrecta lectura fluorescente (figura 2).
Una limitación del solo-gusano, la proyección de imagen basada en la trampa es que solamente un gusano puede ser reflejada en un tiempo de1. Otra limitación de estas trampas es que gusanos pueden atascarse dentro del dispositivo, provocando dispositivos para estar tapado y "utilizado para arriba" después de sólo unos pocos gusanos la proyección de imagen. Sin embargo, el tiempo de respuesta rápido para la fabricación de nuevos dispositivos de un molde maestro alivia este inconveniente. Iluminación luz azul extendida también se ha demostrado para inducir el fotodaño en C. elegans32,33. El relativamente corto plazo experimental de este protocolo (30 s) permite la proyección de imagen sin fotoblanqueo medible. Sin embargo, para evitar el fotoblanqueo y fotodaño en experimentos más, la fuente de luz puede ser pulsada7. Por ejemplo, durante cada exposición de 100 ms, la luz puede ser pulsada para 10 Sra. esto se ha demostrado para eliminar corporal autofluorescencia en tiempo7.
Para probar adecuadamente los machos para sus respuestas a ascarosides, los machos (L4) 4 etapa larval primero deben ser aislados de hermafroditas, durante al menos 5 h, con el fin de lograr una respuesta cerca de ingenua a la feromonas23. Aislamiento por menos de este período de tiempo puede causar animales que no responden a la ascarosides. Sin embargo, este aislamiento no es necesario cuando se prueba no ascaroside señales, tales como glicerol. Aras de la coherencia, sin embargo, los animales siempre fueron aislados por lo menos 5 h antes proyección de imagen de calcio. En algunas neuronas, tales como el CEM, no cada estímulo elicite una respuesta neuronal, y cada CEM que responde hace para generar un cierto "código" de la representación de los nervios. Se ha observado este fenómeno en CEM mediante estudios de electrofisiología, así como con los estudios por imágenes como las describen aquí23de calcio. Por lo tanto, transitorios medibles de calcio en las neuronas de la CEM en todos los animales expuestos al ascaroside no se garantizan23. De hecho, muchos de los ascarosides investigados hasta la fecha no provocan medibles calcio transitorios13,15,34,35. La elicitación exitosa de transitorios medibles se observó durante sólo uno de tres pulsos de feromonas en dos de los cinco animales expuestos a la ascaroside de interés (figura 3). Esto coincide con la tasa de éxito observado previamente en otros laboratorios23. Esta variabilidad es una limitación al estudiar la respuesta de feromona y no por el enfoque basado en el hombre del presente Protocolo.
La investigación de oscilaciones de calcio provocadas en respuesta a ascarosides, uno no debe desestimar la falta de respuesta coherente sin más investigación. Esto puede probarse mediante experimentos como estudios de electrofisiología para confirmar la respuesta variable dentro de una clase neuronal. Para las neuronas, tales como ceniza, responder confiablemente, una falta de respuesta coherente podría ser indicativa de problemas experimentales más grandes, tales como errores en el control de estímulo. La intensidad máxima de las respuestas también se puede investigar si se espera que la variabilidad en la respuesta. Los rastros se pueden trazar con la desviación estándar o error estándar (como en la figura 2F). Si la desviación es pequeña, los rastros pueden trazar y analizados como tal. Si hay una notable cantidad de variación que conduce a desviaciones moderadas, los datos pueden ser trazado el mismo, con el acompañamiento de heatmaps ordenados por respuesta "tipo" para mostrar la variación de la respuesta por respuesta. Si hay una variación significativa (figura 3), en donde los picos no pueden ser distribuidos de forma gaussiana, las respuestas pueden ser categorizadas en respuesta "tipo" (p. ej., despolarizante, hiperpolarizantes o no polarizante)23. Respuestas que caen en un cierto "tipo" pueden ser trazadas y analizaron juntos. Del mismo modo, heatmaps deben acompañar este análisis así.
Avanzando, este dispositivo puede ser adaptado para permitir la proyección de imagen de etapas larvarias de nematodos estrechando aún más el puerto de carga. Mayor estrechamiento del final del puerto de carga permite la restricción del animal para permitir la proyección de imagen de sólo los cilios de las neuronas sensoriales, en comparación con el cuerpo de la célula. Mientras que otros dispositivos están diseñados para el hermafrodita más comúnmente estudiado, este chip olfativa adaptado permite la proyección de imagen de actividad neural en circuitos neurales masculinos. Como el conectoma del varón es ser aclarado aún, ser capaz de medir la dinámica neuronal en las redes del sexo es fundamental para comprender plenamente la señalización neuronal. Las diferencias entre las respuestas masculinas y hermafroditas ahora pueden ser probadas y medición utilizando este dispositivo.

Dispositivos microfluídicos proporcionan mayor acceso a precisamente ambientes controlados, en donde animales, tales como el nematodo C. elegans, pueden ser manipuladas experimentalmente1. Estos estudios incluyen ensayos de comportamiento, estudios de imagen del calcio o incluso proyecciones de fenotipos específicos, dando lugar a medidas más exactas de los resultados experimentales1,2,3,4, 5,6. Microfluídica proporciona condiciones líquidas en pequeña escala a través del cual se pueden ejecutar experimentos detallados utilizando cantidades mínimas de reactivos. Hay una producción constante de nuevos diseños de dispositivos microfluídicos y el uso de cada uno varía, de arenas que permiten el movimiento sinusoidal natural de C. elegans en los análisis de comportamiento y estudios de imagen neurales atrapar los dispositivos usados en la proyección de imagen neuronal y olfativas, dispositivos que permiten análisis fenotípico de alto rendimiento en genética pantallas4,5,6,7. Después de la fabricación de un molde maestro, dispositivos microfluídicos son económicos construir — dada la reutilización del maestro y fácil de usar, que permite la generación rápida de datos a través de estudios de alto rendimiento. La fabricación de dispositivos con polímeros como el polidimetilsiloxano (PDMS) permite la creación de nuevos dispositivos dentro de las horas.
Estudios de imagen del calcio utilizan indicadores de calcio genéticamente codificados (GECIs) expresados en las células diana para medir la dinámica neural de las células en tiempo real8,9,10,11. La naturaleza transparente de C. elegans permite la grabación de los fluorescentes niveles de estas proteínas en animales vivos. Tradicionalmente, GECIs dependen de la proteína fluorescente verde (GFP)-basado en sensor GFP-Calmodulin-M13 péptido (GCaMP), aunque estudios más recientes han adaptado estos sensores para permitir mejor cocientes signal-to-noise y perfiles de excitación rojo-cambiado de puesto. Tras el desarrollo de GCaMP3, han variado las proteínas con estas especificaciones, incluyendo sensores como GCaMP6s y GCaMP6f (lento y rápido de la fluorescencia de las tasas, respectivamente), así como de Peptide de la Calmodulin-RFP-M13 (RCaMP), que tiene un rojo-cambiado de puesto Perfil de activación. La combinación de estos GECIs con secuencias de promotor de genes específicos de células de C. elegans puede atacar las células de interés, las neuronas sensoriales particularmente12,13,14,15 , 16.
Mientras que la facilidad de uso de C. elegans en estudios de microfluidos es evidente, casi todos los estudios se han centrado en hermafroditas. A pesar de los varones sólo representan 0.01-0.02% de la población de tipo salvaje, invaluables resultados pueden derivarse de su caracterización. Mientras que el conectoma físico del sistema nervioso hermafrodita se ha trazado completamente para décadas17, el conectoma masculino sigue siendo incompleta, especialmente en la región central de los animales18. El uso de la proyección de imagen de calcio en hombres ayudarán a generar una comprensión del sistema nervioso masculino y las diferencias que surgen entre los dos sexos. El tamaño más pequeño de los machos adultos de C. elegans previene la captura eficaz y fiable en los puertos de carga de dispositivos olfativos tradicionales diseñados para hermafroditas más grandes. Para hacer frente a esto, una versión modificada del Chip olfativa Chronis19 fue desarrollada con un puerto de carga más estrecho, una altura más baja del canal y se convierte en el gusano puerto de cargamento (que rotan el animal), lo que permite la visualización de izquierda bilateral pares de neuronales. Este diseño permite: (1) la captura efectiva de jóvenes machos, (2) una orientación más confiable del animal para la visualización de ambos miembros de neuronas pares bilaterales y (3) la proyección de imagen exacta de la actividad neuronal en las neuronas masculinas.
Cada vez más, los estudios demuestran que los machos de C. elegans responden diferentemente que hermafroditas a una variedad de ascarosides (ascr), o nematodo feromonas20,21,22,23 ,24. Por lo tanto, desarrollar una comprensión de la dinámica neuronal y representaciones dentro el conectoma masculino se ha convertido en aún más pertinente. Macho de C. elegans contiene 87 neuronas específicas por sexo no está presentes en el hermafrodita25,26, alterando el conectoma en como-formas aún por determinar. Pudiendo esta única dinámica neural de la imagen nos permitirá entender mejor las respuestas específicas por sexo y las representaciones neurales.
Este protocolo describe el uso de un chip olfativo hombre adaptado para la proyección de imagen neuronal del hombre C. elegans chemosensation. La neurona nociceptiva que Ash responde confiablemente a glicerol de 1 M en los machos, consistentes con anteriores hermafrodita estudios27. Exposición a ascarosides puede provocar respuestas que son variables de animal a animal, que requieren un mayor número de animales a ensayar. La respuesta de las neuronas del CEM hombre específicos se ha demostrado previamente, a través Electrofisiología y calcio, los estudios por imágenes para responder variable a ascaroside #323.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Soft Tubing</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Hard Tubing</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425&quot; OD x .500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>3 mL syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Used as buffer reservoirs.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator Control System LF-5 Plasma System</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Desicator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm inner diameter.</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipettes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Model Number: 1500E.</td></tr><tr><td>60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Illumination Adaptor</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>3-way valve for controlling flow.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&amp;reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [p&lt;em&gt;sra&lt;/em&gt;-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 line</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[p&lt;em&gt;pkd&lt;/em&gt;-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; &lt;em&gt;pha&lt;/em&gt;-1(e2123ts); &lt;em&gt;him&lt;/em&gt;-5(e1490); &lt;em&gt;lite&lt;/em&gt;-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Reservoir&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>To create a Reservoir: A &quot;30 mL syringe&quot;, is connected to a &quot;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&quot;, which is connected to a &quot;3 mL syringe&quot; and a &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot;. The &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot; is then inserted into &quot;Soft Tubing&quot; approximately 1/3 of the way down the needle.</td></tr></tbody></table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

El uso de indicadores de calcio ha mejorado enormemente nuestra comprensión de la dinámica neuronal y regulación. El nematodo Caenorhabditis elegans, con su sistema nervioso completamente mapeado y anatomía transparente, presenta un modelo ideal para comprender la dinámica neural en tiempo real utilizando indicadores de calcio. En combinación con tecnologías de microfluidos y diseños experimentales, estudios de proyección de imagen de calcio utilizando estos indicadores se realizan en animales de movimiento libre y atrapados. Sin embargo, la mayoría de los estudios anterior utilizando dispositivos de captura, como el chip olfativo descrito en Chronis et al., tiene dispositivos diseñados para el uso en el hermafrodita más comunes, como el hombre menos común es morfológico y estructural disímiles. Un chip adaptado olfativo fue diseñado y fabricado para incrementar la eficiencia en masculino imagen neuronal con el uso de los animales adultos jóvenes. Una vez se incorporó en el gusano que se carga del puerto para rotar los animales y para permitir la separación de las neuronas individuales dentro de un par bilateral en proyección de imagen de 2D. Gusanos son expuestos a un flujo controlado de odorante en el dispositivo de microfluidos, como se ha descrito en estudios previos de hermafrodita. Oscilaciones de calcio se analizan utilizando el software de la abrir-fuente ImageJ. El procedimiento descrito en este documento debe permitir un aumento en la cantidad de hombre basado en C. elegans calcio proyección de imagen estudia, profundizando nuestra comprensión de los mecanismos de señalización neuronal del sexo.

Un ejemplo de la configuración de dispositivo general puede verse en la figura 1A-B. Figura 1A representa la construcción del reservorio apropiado y configuración. Figura 1B muestra las conexiones de los embalses al dispositivo de microfluidos. Figura 1 muestra un dispositivo de microfluidos con puertos individuales para claridad.
El diseño del dispositivo microfluídico adaptados al hombre contiene una curva en el puerto de carga, pero la dinámica del flujo es idéntico al dispositivo diseñado por Chronis et al19(figura 2A-2 C). El flujo de reservas puede controlarse modificando que fluyen válvula de control está abierta (figura 2A-2B). Las medidas del dispositivo como fabricados varían desde el archivo de diseño. Las mediciones en la figura 2 son medidas "como inventadas".
Después de cargar el macho de C. elegans en el aparato olfativo adaptados al hombre, su colocación y la orientación, así como la dinámica del flujo del canal, puede verificarse a través de campo brillante y la proyección de imagen fluorescente (Figura 2D-2E). La exposición de gusanos expresando GCaMP3 de la neurona nociceptiva, ceniza, a 1 M glicerol produce cambios visibles en fluorescencia dentro de la neurona de ceniza, indicativa de actividad neural (figura 2F). Sutiles cambios en la fluorescencia pueden no ser visibles por el ojo, pero el software puede ser usado para cuantificar estos cambios. El software ImageJ gratis puede utilizarse para analizar y cuantificar la intensidad fluorescente de las neuronas de la ceniza con la exposición a 1 M de glicerol en el tiempo (figura 2F). Esto es similar a lo que se observa en hermafroditas27 y, debido a la robustez de la respuesta neuronal de la ceniza a glicerol, esto se observa en todos los animales probados.
Se espera una pequeña cantidad de movimiento axial o rotacional unparalyzed animales, a menudo haciendo necesario un algoritmo de seguimiento de la neurona durante el análisis de vídeo (Figura 3A). La adición de un paralítico en los amortiguadores (por ejemplo, 1 mM tetramisole) casi elimina este efecto, aunque algunos animales (~ 10%) todavía se mueven durante los ensayos. Esto puede ser eludido por: (a) con más viejos varones, que son atrapados más eficientemente; (b) disminución de la anchura o espesor del gusano carga puerto aún más; o (c) o bien aumentando la concentración de paralítico utilizado o con otro paralítico. Esto asegurará también que no hay demasiado de la cabeza más allá del extremo de la trampa y expuestos al canal de olor. Si se produce un juicio con el movimiento del gusano, el área de análisis puede moverse y releer desde la nueva ubicación neuronal, a partir de la estructura después de que el movimiento produce (figura 3B). Reconstrucción manual de las huellas neuronales por parte del usuario es necesaria en este caso. Scripts que analizar los cambios fluorescentes dentro de la neurona y que centro de la neurona como se mueve se puede también escribir19.
Macho de C. elegans sentido atractivas feromonas biogénicas llamadas ascarosides a través de los cuatro sexo CEM neuronas23. Cuando oscilaciones de calcio se observan en varones, las respuestas son variables en forma, signo y magnitud entre las neuronas y animales (Figura 4A-B). Sin embargo, respuesta masculina a las feromonas no se observa tan confiablemente como oscilaciones de calcio en muchos animales (figura 4). Esto no es desalentador, como ascarosides la mayoría no provocan a oscilaciones de calcio sobre sensación13,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig3.jpg"> 
Figura 3: movimiento de gusano abordando durante el período de adquisición de imagen. (A) ΔF/F0 (cambio en la intensidad fluorescente dividido por la intensidad fluorescente de fondo promedio para el primer 1 s de adquisición) se calculó con ImageJ mediante la definición de un área donde la neurona de interés era confiablemente estática para 1 s. Durante el pulso de estímulo (zona azul), el animal se movió, como se ve en las imágenes sobre el rastro de calcio, dando por resultado la neurona ya no está contenida dentro del área analizado (cuadro amarillo). Las barras de escala denotan 42 μm. la demostración de las líneas punteadas la región de la traza que corresponde a la localización del gusano en cada imagen. (B) si el área de análisis se desplaza hacia la neurona durante el juicio y se reconstruyen los rastros individuales para transmitir la real dinámica neuronal, el rastro aparece como si el animal no se movió. Las líneas discontinuas muestran la región de la traza que fue corregida para el movimiento del gusano. Rastros de ceniza las neuronas, izquierda y derecha (ASHL (rojo) y ASHR (azul), respectivamente) se muestran. Los ejes muestran ΔF/F0. La barra de escala indica 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56026/56026fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig4.jpg"> 
Figura 4: Macho C. elegans CEM respuesta a 1 μM ascr #3 es variable. Las neuronas CEM específicas hombre mostrar patrones únicos de respuesta a las feromonas biogénicas. (A) se muestran las respuestas observadas en cada neurona CEM para un pulso en un animal receptivo. Hay cuatro neuronas CEM: dorsal derecha (CEM DR), dorsal izquierda (CEM DL), ventral derecha (CEM VR) y ventral izquierda (CEM VL). Tres de las cuatro neuronas responden con despolarizaciones de diferentes forma y magnitud, con el cuarto no responde a la ascaroside. (B) aproximadamente un tercio de los animales atrapados (2/7 probado en este estudio) resultado en solamente tres neuronas capaces de ser reflejada. Las respuestas de un gusano en esta orientación dio lugar a oscilaciones de calcio CEM que eran diferentes a los observados en el primer gusano. Esto no fue debido al cambio de orientación del gusano, como el Dr. CEM es visible en ambas orientaciones y exhibe respuesta variable entre animales. (C) muchos gusanos no responder con cualquier transitorios de calcio detectables (5/7 probado en este estudio). Los rastros que se muestra son representativos de los animales solo que se muestra en las imágenes por encima de las parcelas. Elbarras de escala denotan 42 μm. rastros: el área azul indica el tiempo de exposición de ascr #3 de 1 μM. Los rastros rojos denotan la respuesta despolarizante. Los rastros negros no denotan respuesta observada. Los ejes muestran ΔF/F0. La barra de escala indica 5 s. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56026/56026fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans

El uso de un chip olfativo de"adaptado" para la proyección de imagen del calcio eficiente de los machos de C. elegans se describe aquí. También se muestran estudios de exposición masculina a glicerol y una feromona.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.1K vistas.  Worcester Polytechnic Institute. El uso de un chip olfativo de"adaptado" para la proyección de imagen del calcio eficiente de los machos de C. elegans se describe aquí. También se muestran estudios de exposición masculina a glicerol y una feromona.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Investigación

Bioingeniería

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociencias

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Extracción y cuantificación de respuestas de feromonas sexuales volátiles en C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Examinando la influencia de las feromonas sexuales volátiles en el comportamiento de los machos de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Comportamiento

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans

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Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans