Name: new methods to study gustatory coding
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
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Este trabajo fue apoyado por una subvención intramural de NIH-NICHD a MS Agradecemos a G. Dold y T. Talbot de la NIH-NIMH Instrumentation Core Facility para la asistencia con el diseño del sistema de suministro de saborizante.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos aquí descritos permiten las grabaciones in vivo de un animal relativamente simple, Manduca sexta , para caracterizar la actividad de GRNs múltiples seleccionados al azar durante largas duraciones (durante más de 2 h), antes, durante y después del parto de saborizante. Estos métodos también permiten la entrega rápida y secuencial de estímulos tastantes múltiples con control temporal preciso, ventajas que son útiles para estudiar los mecanismos neuronales subyacentes a la representación del saborizante. Este protocolo se ha utilizado para estudiar cómo las respuestas de GRNs a los tastants se transforman cuando se transmiten a sus neuronas objetivo postsinápticas ( por ejemplo, en la SEZ) mediante la monitorización de GRNs simultáneamente conectados monosinápticamente interneuronas [ 10] . Además, estos métodos pueden adaptarse a las necesidades del experimentador, permitiendo la ejecución de paradigmas complejos para estudiar aspectos fundamentales de la codificación gustativa. Cuando empieceEn nuestros estudios, un problema técnico que a veces tuvimos que solucionar fue la incapacidad de detectar las señales de clavado del nervio maxilar con los cables del tetrodo. Las posibles causas de esto son diversas, ya que el protocolo de disección es un desafío, y alguna práctica es necesaria para obtener una buena preparación. En primer lugar, durante la disección de la polilla los nervios maxilares son fáciles de dañar, especialmente durante la eliminación de la envoltura que rodea el tejido nervioso. En segundo lugar, si la vaina no se retira completamente, los cables del tetrodo pueden no ser capaces de acceder al nervio. En ambos casos, comenzar una nueva preparación es a menudo la manera más fácil de resolver estos problemas. En tercer lugar, puede haber un problema con los cables de tetrodo. Esto se puede comprobar midiendo la impedancia de los alambres que debe ser ~ 270 kΩ en 1kHz. Si el valor de la impedancia es superior a 300 kΩ, aplique los hilos metálicos con oro para obtener la impedancia deseada (véase la referencia 30 ). En cuarto lugar, un equipo puede estar mal conectadoO mal comportamiento. Otro posible problema es que se registran señales de picos, pero la (s) neurona (s) no responden a los tastantes. Esto podría ser debido a que las neuronas registradas son insensibles al conjunto de tastantes entregados. Además, es importante tener en cuenta que además de los axones de GRNs, el nervio maxilar también lleva fibras mecanosensoriales. Por lo tanto, es posible grabar de las neuronas mechanosensory en lugar de, o en adición a, GRNs. Sin embargo, el sistema de suministro de saborizante está diseñado para proporcionar un aporte mecánico constante a lo largo del experimento, haciendo improbable que las respuestas a un saborizante sean confundidas por las respuestas al componente mecánico de su suministro. Las neuronas que responden a algunos pero no a otros tastantes, o de diferentes maneras a diferentes tastantes, se pueden clasificar inequívocamente como GRNs. Recomendamos el uso de tostantes recién diluidos para evitar variaciones en la concentración o composición del saborizante debido a la degradación o evaporación del compuestoDel disolvente. También recomendamos limpiar el sistema con regularidad para evitar la contaminación del tubo y / o obstrucciones. Otro posible problema técnico es una relación señal-ruido desventajosa. Este problema puede resolverse a menudo mediante la renovación o el ajuste de la posición del electrodo de tierra del baño. Otras soluciones pueden requerir blindaje y minimizar la longitud de cada conexión eléctrica en el aparato. Por último, es importante señalar que el análisis correcto de los datos obtenidos mediante grabaciones de tetrodos requiere una cuidadosa clasificación por punta. Encontramos que los métodos completamente automatizados son generalmente inadecuados. Recomendamos familiarizarse con la literatura de clasificación de espigas antes de analizar los datos de tetrodo 10 , 29 , 31 , 32 , 33 . Alternativas a nuestra disecciónTocol puede ser utilizado. Aquí se describe una disección a través de la parte ventral de la cabeza de la polilla, que proporciona acceso a los nervios maxilares y SEZ, pero también es posible acceder a estas estructuras por disección a través del lado dorsal. Encontramos que la preparación del lado dorsal no es óptima para hacer grabaciones de estas estructuras gustativas debido a su ubicación profunda, pero esta preparación ofrece la ventaja de permitir grabaciones de estructuras de orden superior, como el cuerpo de hongo, un área que ha sido asociada con multi - integración sensorial, aprendizaje asociativo y procesamiento de la memoria 34 . Nos hemos centrado en el uso de electrodos de tetrodo para grabar desde el nervio maxilar, pero, como hemos ilustrado, también se pueden utilizar electrodos afilados intracelulares estándar para este propósito. Además, ambas técnicas se pueden combinar para realizar grabaciones simultáneas de múltiples áreas cerebrales [ 10] . La literatura de neurociencia ofrece muchos ejemplos de iNvertebrados que han demostrado ser herramientas poderosas para revelar los principios fundamentales del procesamiento sensorial, como la codificación olfativa, que se aplican tanto a los insectos como a los vertebrados 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Esperamos que nuestros métodos lleven a nuevos conocimientos fundamentales sobre la codificación gustativa.

Los sistemas gustativo y olfativo generan representaciones internas de sustancias químicas en el medio ambiente, dando lugar a percepciones de gustos y olores, respectivamente. Estos sentidos químicos son esenciales para obtener numerosos comportamientos críticos para la supervivencia del organismo, que van desde encontrar compañeros y comidas hasta evitar depredadores y toxinas. El proceso comienza cuando los químicos ambientales interactúan con los receptores situados en las membranas plasmáticas de las células sensoriales receptoras; Estas células, directamente oa través de interacciones con neuronas, transducen información sobre la identidad y concentración de sustancias químicas en señales eléctricas. Estas señales se transmiten a neuronas de orden superior ya otras estructuras cerebrales. A medida que estos pasos progresan, la señal original siempre experimenta cambios que promueven la capacidad del organismo de detectar, discriminar, clasificar, comparar y almacenar la información sensorial, y seleccionar una acción apropiada. Comprender cómo el sujetadorEn transforma la información sobre los productos químicos ambientales para realizar mejor una variedad de tareas es una pregunta básica en neurociencia. Se ha pensado que la codificación gustatoria es relativamente simple: una opinión ampliamente sostenida postula que cada molécula química que provoca un sabor (un &quot;saborizante&quot;) pertenece naturalmente a una de las aproximadamente cinco cualidades básicas de sabor ( es decir , dulce, amarga, agria , Salado y umami) 1 . En esta visión del &quot;gusto básico&quot;, el trabajo del sistema gustativo es determinar cuál de estos sabores básicos está presente. Además, los mecanismos neuronales que subyacen a la representación básica del gusto en el sistema nervioso no son claros y se piensa que están gobernados por una &quot;línea marcada&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o un &quot;patrón transversal de fibras&quot; 7 </suP&gt; , 8 código. En un código de línea etiquetado, cada célula sensorial y cada uno de sus seguidores neurales responde a una única cualidad de sabor, formando juntos un canal directo e independiente a centros de procesamiento superiores en el sistema nervioso central dedicado a ese gusto. Por el contrario, en un código de patrón de fibra transversal, cada célula sensorial puede responder a múltiples cualidades gustativas de modo que la información sobre el saborizante está representada por la respuesta global de la población de neuronas sensoriales. Si la información gustativa está representada por gustos básicos, a través de líneas etiquetadas, oa través de algún otro mecanismo, no está claro y es el foco de la investigación reciente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nuestro trabajo reciente sugiere que el sistema gustativo utiliza un código de población spatiotemporal para generarRepresentaciones de tastantes individuales en lugar de categorías básicas de gusto 10 . Aquí ofrecemos 3 nuevas herramientas para ayudar en el estudio de la codificación gustativa. En primer lugar, se sugiere el uso de la hawkmoth Manduca sexta como un organismo modelo relativamente simple susceptible de estudio electrofisiológico del gusto y describir un procedimiento de disección. En segundo lugar, sugerimos el uso de &quot;tetrodos&quot; extracelulares para registrar la actividad de GRNs individuales. Y en tercer lugar, se sugiere un nuevo aparato para la entrega y el seguimiento de pulsos de tastante precisamente sincronizados al animal. Estas herramientas fueron adaptadas de las técnicas de nuestro laboratorio y otros han utilizado para estudiar el sistema olfativo. Insectos como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , la langosta Schistocerca americana , así como la polilla Manduca sexta, han proporcionado desde hace décadas recursos poderosos para entender los principios básicos sobre el nerIncluyendo la codificación sensorial ( p. Ej., El olfato 13 ). En los mamíferos, los receptores del gusto son células especializadas que se comunican con las neuronas a través de vías complejas de segundo mensajero 1 , 14 . Es más sencillo en los insectos: sus receptores del gusto son neuronas. Además, las vías gustativas de mamíferos cerca de la periferia son relativamente complejas, con múltiples rutas neuronales paralelas, y los componentes importantes son difíciles de acceder, contenidos dentro de estructuras óseas pequeñas [ 15] . Las vías del gusto del insecto parecen ser más simples. En los insectos, los GRN están contenidos en estructuras especializadas conocidas como sensilla, localizadas en la antena, piezas bucales, alas y patas 16 , 17 . Los GRNs se proyectan directamente a la zona subesofágica (SEZ), una estructura cuyo papel se ha pensado que es principalmente de tipo gustativo17, y que contiene un segundo ordenNeuronas gustativas 10 . A partir de ahí la información viaja al cuerpo para impulsar los reflejos, ya las áreas cerebrales superiores para ser integradas, almacenadas y, finalmente, para impulsar las elecciones conductuales 16 . Es necesario caracterizar las respuestas gustativas periféricas para comprender cómo se propaga y se transforma la información del gusto de un punto a otro en todo el sistema nervioso. El método más comúnmente usado para monitorear directamente la actividad neural de GRNs en insectos es la técnica de registro de punta 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Esto implica colocar un electrodo directamente sobre un sensor, muchos de los cuales son relativamente fáciles de acceder. El saborizante se incluye dentro del electrodo, lo que permite activar y extMiden de manera raconular las respuestas neuronales de GRNs en el sensillum. Sin embargo, debido a que el saborizante está contenido en el electrodo, no es posible medir la actividad de GRN antes de que el saborizante sea suministrado o después de ser retirado, o para intercambiar tastantes sin reemplazar el electrodo 20 . Otro método, la técnica de grabación de &quot;pared lateral&quot;, también se ha usado para registrar la actividad de GRNs. Aquí, se inserta un electrodo de registro en la base de un sensor de sabor 24 , y los saborizantes se suministran a través de un capilar de vidrio separado en la punta del sensor. Ambas técnicas restringen la grabación de GRNs a un sensillum particular. Aquí, se sugiere una nueva técnica: la grabación de seleccionados aleatoriamente GRN axones de diferentes sensilla, a la vez que la entrega de secuencias de tastantes a la probóscide. Las grabaciones del axón se logran colocando electrodos de cristal afilados o haces de electrodos extracelulares (tetrodos) en el nervio que lleva los axones deGRNs en la probóscide a la SEZ 10 . En Manduca , estos axones atraviesan el nervio maxilar, que se sabe que es puramente aferente, lo que permite el registro inequívoco de las respuestas sensoriales [ 25] . Este método de registro de axones, permite, durante más de dos horas, la medición estable de GRN respuestas antes, durante y después de una serie de presentaciones de sabor. En este sentido, describimos un procedimiento de disección para exponer los nervios maxilares junto con la SEZ, lo que permite registrar simultáneamente las respuestas de múltiples GRNs y neuronas en la SEZ 10 . También se describe el uso de grabaciones extracelulares de GRNs utilizando un tetrodo de alambre retorcido de 4 canales hecho a la medida que, combinado con un método de clasificación por puntas, permite el análisis de múltiples (en nuestras manos, hasta seis) GRNs simultáneamente. Comparamos también las grabaciones realizadas con tetrodos a grabaciones realizadas conElectrodos Finalmente, describimos un nuevo aparato para la liberación de estímulos tastantes. Adaptado de equipos utilizados por muchos investigadores para suministrar odorantes en estudios de olfacción, nuestro nuevo aparato ofrece ventajas para estudiar gustation: mejorando el sistema de distribución multicanal anterior, como los desarrollados por Stürckow y colegas (ver referencias 26 , 27 ) Control sobre la temporización de la entrega de saborizante mientras proporciona una lectura de voltaje de esta temporización; Y permite la entrega rápida y secuencial de múltiples estímulos tastantes [ 10] . El aparato baña la probóscide en un flujo constante de agua limpia en el que pueden suministrarse impulsos controlados de saborizante. Cada pulso de sabor tostador pasa sobre la trompa y luego es lavado. Los saborizantes contienen una pequeña cantidad de colorante de alimentos insípido, permitiendo que un sensor de color para monitorear, con tiempo preciso, el paso de tastante ovLa probóscide.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and Specimen Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tube, 15 mL Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2&quot;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;MONOJET</td><td>888200144</td><td>For applying air to remove the hair from the moth.</td></tr><tr><td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&amp;nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish -100 x 15 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tip (1 - 200 &amp;micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG standard hookup wire</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td></tr><tr><td>Batik wax</td><td>Jacquard</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>Electric waxer</td><td>Almore International</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Myscroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 forceps (coarse)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>For removing fat and non-nervous tissue.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>For desheathing the nervous tissue.</td></tr><tr><td>Vannas scissors (fine)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>For removing the cuticle.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline Perfusion System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extension set with rate flow regulator</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV administration set with Y injection site</td><td>&amp;nbsp;B Braun Medical Inc.</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastant Delivery System&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&quot;, ID 1/8&quot;</td><td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td></tr><tr><td>Soldering iron</td><td>Circuit Specialists</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>Rotary tool-Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&amp;nbsp;</td><td>Industrial Netting</td><td>XN5170</td><td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td></tr><tr><td>Pressurized 16-Channel perfusion system&amp;nbsp;</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-16H</td><td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.</td></tr><tr><td>Polypropylene tubing, ID 0.034&quot;, ID 0.050&quot;</td><td>Becton, Dickinson &amp;amp; Co</td><td>427421</td><td>Output tube from the perfusion system.</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>For controlling the output channel of the perfusion system.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>For pumping water.</td></tr><tr><td>Silicone tubing, ID 1/16&quot; OD 1/8&quot;</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td></tr><tr><td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td><td>Keyence</td><td>&amp;nbsp;FS-V31M</td><td>For monitoring tastant delivery.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Color sensor-reflective fiber unit</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>To connect the color sensor device.</td></tr><tr><td>Dental periphery Wax</td><td>Henry-Schein Dental</td><td>6652151</td><td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td></tr><tr><td>Two 3.7 L containers</td><td></td><td></td><td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td></tr><tr><td>Fast green FCF&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>Dressing forceps 25.5 cm</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electrophysiology Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.C. amplifier</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Leica</td><td>micromanipulator</td><td>To precisely insert the tetrodes into the animal&#039;s brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&amp;nbsp;</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td><td>16 Channel MA-800 Amplifier System&amp;nbsp;</td><td>B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core&amp;nbsp;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tastants&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

new methods to study gustatory coding

El sentido del gusto permite a los animales detectar los productos químicos en el medio ambiente, dando lugar a comportamientos críticos para la supervivencia. Cuando las Neuronas Receptoras Gustatorias (GRNs) detectan moléculas tastantes, codifican información sobre la identidad y concentración del saborizante como patrones de actividad eléctrica que luego se propagan a las neuronas seguidoras del cerebro. Estos patrones constituyen representaciones internas del tastante, que luego permiten al animal seleccionar acciones y formar recuerdos. El uso de modelos animales relativamente simples ha sido una poderosa herramienta para estudiar los principios básicos en la codificación sensorial. Aquí, proponemos tres nuevos métodos para estudiar la codificación gustativa utilizando la polilla Manduca sexta . En primer lugar, se presenta un procedimiento de disección para exponer los nervios maxilares y la zona subesofágica (SEZ), permitiendo registrar la actividad de GRNs desde sus axones. En segundo lugar, se describe el uso de electrodos extracelulares para registrar la actividad de múltiples GRNs colocando teTrode directamente en el nervio maxilar. En tercer lugar, se presenta un nuevo sistema de entrega y seguimiento, con alta precisión temporal, pulsos de diferentes tastantes. Estos métodos permiten la caracterización de respuestas neuronales in vivo directamente a partir de GRNs antes, durante y después de la liberación de los saborizantes. Proporcionamos ejemplos de trazas de voltaje grabadas a partir de GRN múltiples y presentamos un ejemplo de cómo una técnica de clasificación por punta puede aplicarse a los datos para identificar las respuestas de neuronas individuales. Por último, para validar nuestro enfoque de grabación, se comparan las grabaciones extracelulares obtenidas de GRN con tetrodos a las grabaciones intracelulares obtenidas con electrodos de vidrio afilado.

La actividad de los GRN se puede registrar usando un electrodo de tetrodo extracelular antes, durante y después de la liberación del saborizante ( Figura 6A y 6C ). La Figura 6A (paneles central e inferior) muestra trazas de voltaje filtradas (300-6.000 Hz) registradas por cada uno de los cuatro cables colocados en el nervio maxilar, donde se pueden observar señales de amplitudes diferentes que reflejan potenciales de acción (flechas). Se suministró un pulso de 1 s de saborizante (sacarosa 1 M) 2s después del comienzo del experimento; El inicio y el desplazamiento del estımulo fueron monitorizados por el sensor de color ( Figura 6A , panel superior). El saborizante indujo picos que se pueden observar en cada uno de los cuatro canales ( Figura 6A , panel del medio). GRNs se pueden identificar y distinguir de los mecanosensores (no se muestra aquí) cuando responden a algunos tastantes y no otros Para identificar y aislar las respuestas neuronales individuales de las grabaciones de tetrodos, se realizó la clasificación de picos fuera de línea utilizando un conjunto de funciones personalizadas basadas en los métodos de Pouzat 31 y Kleinfeld 32 , 33 (estos métodos se describen en estas citas 10 , 29 ). La Figura 6B muestra un ejemplo de clasificación por punta aplicada a los datos mostrados en la Figura 6A , en la que se encontraron tres unidades bien aisladas. Las gráficas ráster de la Figura 6C representan respuestas de las tres unidades aisladas en la Figura 6B a seis tastantes diferentes (sacarosa 1 M, maltosa y NaCl, 100 mM de cafeína y 10 mM de berberina y lobelina) entregados en secuencia (4 ensayosS / tastant se muestran). Como se muestra en la Figura 6C , los GRNs grabados tienen diferentes niveles de actividad basal, que van desde silenciosa (GRNs 1) a baja o moderada (GRN 2 y 3). Después del inicio del saborizante, los GRN muestran diversos patrones de actividad y exhiben una selectividad diferente a los saborizantes. Por ejemplo, GRN 1 respondió sólo a la sacarosa, mientras que GRN 2 respondió a la maltosa y NaCl con la explosión de picos y lobeline con spiking sólo en el inicio del estímulo. Además, algunas respuestas están bloqueadas al momento del estímulo ( por ejemplo, la respuesta GRN 1 a la sacarosa), mientras que otras respuestas duran más que la duración del estímulo ( por ejemplo, la respuesta GRN 3 a la berberina) o contienen tanto componentes excitadores como inhibidores GRN 2 respuestas a NaCl y sacarosa). Para más información sobre las diversas sensibilidades y los patrones de actividad de los GRN, véase la referencia 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pagePara validar el uso de las técnicas de tetrodo y clasificación de puntas para registrar GRNs del nervio maxilar, realizamos grabaciones intracelulares de axones GRN en otros animales usando electrodos de vidrio afilados convencionales (resistencia de 80-120 MΩ). Se encontró que los patrones de actividad obtenidos mediante el uso de registros intracelulares fueron similares a las respuestas observadas mediante el uso de la técnica de tetrodo ( Figura 7 ]. Los trazos de voltaje en la caja verde en el Panel A se registraron intracelularmente a partir de GRN 1 durante 5 ensayos consecutivos de presentación de sacarosa y las mismas respuestas se muestran como tramas ráster en el panel B. (Obsérvese que este tipo de respuesta coincide con el obtenido con tetródos y Mostrado en la Figura 6C ). GRN 2, registrado con electrodos intracelulares afilados, muestra un patrón de respuesta más amplio. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figura 6: Resultados representativos de las grabaciones del nervio maxilar con tetródos extracelulares. ( A ) Se muestran trazas de voltaje filtradas (300-6.000 Hz) registradas por cada uno de los cuatro alambres en el nervio maxilar (panel del medio). Se aplicó un pulso de 1 s de saborizante durante el periodo de tiempo indicado por sombreado rojo en el panel central. El inicio y el desplazamiento del estímulo fueron monitorizados por el sensor de color como se indica por la traza de voltaje rojo en el panel superior, y se indica en el panel central por el área sombreada en rojo. Las líneas horizontales punteadas indican +50 (arriba), 0 (medio) y -50 (parte inferior) μV. Se muestra una ampliación de las trazas de voltaje bruto correspondientes al área dentro de las líneas punteadas verticales (panel inferior). Ejemplos de picos están indicados por las flechas. ( B ) Ejemplo de clasificación por punta aplicada a los datos mostrados en el panel A. Las formas de onda registradas en cada uno de los cuatro hilos extracelulares (1-4) arE identificado con tres GRN diferentes (unidades 1-3) que contribuyen a las señales grabadas. Se muestran eventos individuales (líneas finas coloreadas) y la media (línea negra gruesa) para las tres unidades. Hay que tener en cuenta una serie de criterios estadísticos para identificar con fiabilidad las unidades independientes utilizando el método de clasificación por punta (véanse las referencias 10 , 29 ). ( C ) Gráficos ráster que representan respuestas de las tres unidades aisladas a una secuencia de seis tastantes diferentes (se muestran 4 ensayos / saborizante). El periodo de tiempo de suministro de saborizante (1 s) se indica por el área sombreada en rojo. Las concentraciones de társidos fueron 1 M (sacarosa, maltosa, NaCl), 100 mM (cafeína) y 10 mM (berberina y lobelina). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7 : Grabaciones intracelulares de los axones de GRN. ( A , panel de la caja verde) Trazas de voltaje registradas de un GRN con electrodos intracelulares de cristal afilado (resistencia de 80 - 120 MΩ) colocados en el nervio maxilar, provocados por 5 estímulos consecutivos con 1 M de sacarosa (Suc). ( B ) Gráficos ráster de las respuestas de dos GRNs, incluyendo las respuestas mostradas en el panel A (panel de caja verde), a dos tastantes diferentes entregados secuencialmente (color de fuente gris 100 mM, 1 M de color de fuente negro) registrados con electrodos intracelulares de vidrio afilado Colocado en el nervio maxilar (se muestran 7 ensayos / saborizante y 3 ensayos / agua). El tiempo de entrega de Tastant está indicado por zonas con sombra roja en ambos paneles. El inicio y el desplazamiento del estímulo fueron monitorizados por el sensor de color, como se indica por los trazos de voltaje rojo en la parte inferior de cada panel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Nuevos métodos para estudiar la codificación gustativa | Neurociencia | Video

New Methods to Study Gustatory Coding

Presentamos tres nuevos métodos para estudiar la codificación gustativa . Utilizando un animal simple, la polilla Manduca sexta ( Manduca ) , describimos un protocolo de disección, el uso de tetródos extracelulares para registrar la actividad de múltiples neuronas receptoras gustativas y un sistema para administrar y controlar pulsos de tastantes precisamente sincronizados.

Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Técnica para recopilar fungiformes (gusto) Las papilas de la lengua humana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Investigación

Medicina

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Electrofisiológico Grabación desde<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Neurociencias

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

Examen de gusto: Una prueba breve y validada

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Tinción, visualización y análisis de papilas gustativas fungiformes, circunvaladas y del paladar

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Un método novedoso para mejorar el análisis de la actividad de las neuronas gustativas de los insectos

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autor destacado: Avances en quimiorrecepción: de los receptores de olor de insectos a los ARN no codificantes

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imágenes de calcio de las respuestas neuronales inducidas por el gusto en Drosophila adulta

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Nuevos Métodos para Estudiar la Codificación Gustatoria

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