Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias otorga IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Agradecemos a Patricia Wittkopp ya tres revisores anónimos por sus útiles comentarios sobre una versión anterior de este documento.

1. Montaje de muestras NOTA: Guarde las moscas muertas en etanol al 70% en agua antes de tomar imágenes. <ol><li> Vierta 10 ml de agar al 1,25% disuelto en agua hirviendo en una placa de Petri de 60 mm x 15 mm y déjela reposar. </li><li> Bajo un microscopio de disección, utilice un par de pinzas de punta fina para hacer una ranura de ~ 20 mm de largo, 2 mm de ancho, 1 mm de profundidad en la superficie del gel. Usando fórceps finos, inserte el lado ventral de una mosca adulta en el surco, con el lado dorsal de la mosca sobresaliendo por encima del gel. NOTA: La holgura del gel permite un fácil reposicionamiento sin dañar el espécimen. La misma ranura se puede utilizar para múltiples especímenes, aunque se ensuciará, se desintegra e inutilizará con el tiempo. El usuario puede entonces hacer otra ranura en el mismo gel. Cada placa se puede utilizar para imagen ~ 200 moscas. </li><li> Cubra completamente el espécimen en etanol al 70% en agua para reducir cualquier reflejo de luz de la cutícula cerosa y para evitar el daño del ala durManipulación de muestras. </li></ol> 2. Configuración del Microscopio NOTA: Las imágenes se obtienen utilizando un alcance de disección, una base de luz transmitida, una cámara digital y una fuente de luz fría de cuello de cisne conectada a un ordenador que ejecuta un software de control de adquisición de imágenes. Las instrucciones de software son específicas de Micro-Manager v1.4.20 44 , que es un software de código abierto que incorpora ImageJ 45 . <ol><li> Encienda el microscopio, la cámara digital, la fuente de luz fría de doble cuello de cisne y la computadora. </li><li> Ejecute el software de captura de imágenes para abrir una ventana de Micro Manager y una ventana de ImageJ. En la ventana de ImageJ haga clic en &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; para establecer todas las imágenes como de 8 bits. Haga clic en &quot;live&quot; en la ventana Micro-Manager para abrir una ventana &quot;Snap / Live&quot; que muestra una vista previa en tiempo real de la cámara. <ol><li> Maximizar el tamaño de la ventana &quot;Snap / Live&quot; si neNecesario Seleccione &quot;Grayscale&quot; en el menú desplegable &quot;Display mode&quot; en la pestaña &quot;Contrast&quot; de la ventana Micro-Manager. </li></ol></li><li> Encienda la fuente de luz fría a su máxima intensidad y coloque las puntas de cada cuello de cisne aproximadamente a 120 mm de la platina, una a la izquierda y otra a la derecha. NOTA: Los usuarios también pueden usar un iluminador anular, aunque esto puede generar un anillo de luz reflejada alrededor del abdomen de la mosca. </li><li> Ajuste manualmente la ampliación del microscopio a 60X para que el campo de visión capture un área de aproximadamente 3 mm de diámetro en el escenario. </li><li> Coloque un micrómetro de etapa de 2 mm en el escenario (cambiando el fondo a blanco si es necesario). Mientras mira la vista previa en vivo, enfoque el micrómetro de la etapa y ajuste la exposición en la ventana Micro-Manager introduciendo el tiempo de exposición en ms en el cuadro &quot;Exposure&quot;. </li><li> Para calibrar espacialmente la cámara, seleccione la herramienta &quot;recta&quot; en tLa ventana de ImageJ y dibuja una línea de la longitud del micrómetro de la etapa. En la ventana ImageJ, haga clic en &quot;Analyze&quot;&gt; &quot;Set Scale&quot; para abrir la ventana &quot;Set Scale&quot;, introduzca la longitud del micrómetro en μm en la casilla &quot;Distancia conocida&quot; e introduzca &quot;μm&quot; en &quot;Unidad de longitud&quot; caja. <ol><li> Observe que la ventana &quot;Set Scale&quot; muestra la escala en &quot;pixels / μm&quot;. Anote la escala y haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li></ol></li><li> En la ventana &quot;Snap / Live&quot;, haga clic en &quot;Stop&quot; y luego en &quot;Snap&quot; para capturar una imagen del micrómetro de la etapa. </li><li> Guarde la imagen como un TIFF de escala de grises de 8 bits para garantizar la capacidad de calibrar espacialmente las imágenes de nuevo si es necesario. En la ventana ImageJ, haga clic en &quot;Archivo&quot;&gt; ​​&quot;Guardar como&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Especifique dónde guardar el archivo en el explorador de archivos, nombre el archivo y haga clic en &quot;Guardar&quot;. </li><li> Cambie el escenario a negro y coloqueUna placa de Petri que sostiene una mosca montada en agar (etapas 1.1-1.2) en la etapa. </li><li> Mire a través del microscopio y la posición de la mosca para asegurarse de que la línea media dorsal es recta con el fin de mejor ver el patrón de pigmentación. Mueva las alas y los apéndices para asegurarse de que la vista del abdomen no esté obstruida. Si la cutícula pigmentada (a2-a5) no es visible, apriete el abdomen lateralmente hasta que esté (aunque el abdomen de las moscas almacenadas en etanol al 70% en el agua se estire, por lo que normalmente no es necesario). NOTA: Al colocar la mosca, es posible que el usuario necesite usar una ampliación inferior (20X). La ampliación debe ser devuelta a 60X antes de proceder. </li><li> Centrarse manualmente en el abdomen dorsal de la mosca. Ajuste manualmente las puntas de la fuente de luz para minimizar las sombras y la reflexión sobre el abdomen dorsal. </li><li> Mientras mira la vista previa en vivo en la pantalla del ordenador y utiliza el histograma de valores de píxeles en la pestaña &quot;Contraste&quot; de la ventana Micro-Manager,Ajuste la exposición como se describe en el paso 2.4 para maximizar el rango de valores de píxeles de la imagen de vista previa. </li><li> Quitar la mosca y la placa de Petri y reemplazarlos por un LED (salida espectral de 430-660 nm) conectado a un medidor de voltaje, centrado en el campo de visión en la misma posición que la mosca. Utilice el LED y el medidor de voltaje como un medidor de luz 46 y registre el voltaje generado por la luz que golpea el LED (~ 125 mV). NOTA: El LED y el medidor de voltaje se usan para asegurar que los niveles de luz sean constantes durante múltiples sesiones de imagen dentro de un solo experimento. </li><li> Durante la duración del experimento, no cambie más la posición o intensidad de la fuente de luz, la ampliación del microscopio o la exposición de la cámara. </li></ol> 3. Imaging de especímenes <ol><li> Coloque una placa de Petri sosteniendo una mosca montada en agar (pasos 1.1-1.3) en la etapa de microscopio negro. Ajuste la posición de la mosca de modo que la tercera y la cuartaH los segmentos abdominales son visibles y la línea media dorsal está hacia arriba, como se describe en el paso 2.9. Asegúrese de que la ampliación esté a 60x antes de continuar. </li><li> Manualmente enfocar el microscopio de tal manera que el tercero y el cuarto dorsal tergites abdominales están en foco. Utilice el software de captura de imágenes para adquirir una imagen como un TIFF de escala de grises de 8 bits, como se describe en el paso 2.6. NOTA: La imagen puede ser capturada en color y posteriormente convertida en escala de grises para su análisis. </li><li> Guarde la imagen como &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, como se describe en el paso 2.7. NOTA: Aquí, [SESH] es constante, [000] es el número de sesión y es variable, pero debe tener tres dígitos y [sampleID] es lo que el usuario desee, aunque no debe contener caracteres de subrayado (_) adicionales y Debe ser de una longitud constante. [ID de la muestra] debe incluir detalles de los factores utilizados en el análisis de los datos de pigmentación ( por ejemplo, la temperatura o el linaje), separados por un distintivo no alfabéticoComo un guión (-). Esto permite que estos factores sean fácilmente analizados de [sampleID] usando software estadístico estándar. </li><li> Retire la placa de Petri de la etapa y reemplace la mosca con la muestra siguiente. Repita los pasos 3.1-3.3 hasta que todos los especímenes hayan sido visualizados, sin ajustar los niveles de iluminación, aumento o exposición. </li></ol> 4. Imaging en varias sesiones <ol><li> Si las imágenes necesitan ser tomadas en varias sesiones, mantenga la intensidad de la luz, la exposición y la ampliación a través de las sesiones. Al comienzo de cada sesión, compruebe la calibración espacial de la cámara (paso 2.4) y la intensidad de la luz en la etapa (medida por el LED / medidor de tensión, paso 2.12). </li><li> Capture y guarde una imagen del micrómetro del escenario (pasos 2.5-2.7) para asegurar la capacidad de calibrar espacialmente las imágenes de nuevo, si es necesario. </li><li> Use al menos 15 muestras de control y repárelas aleatoriamente en cada sesión paraW para la detección y eliminación de efectos de sesión. Asegúrese de que los ejemplares de control duplicados entre sesiones tengan el mismo [ID de muestra] pero diferente [SESH000]. NOTA: Las muestras de control son moscas recogidas, almacenadas y montadas de forma idéntica a los especímenes experimentales, pero son reimaginadas a través de las sesiones. El número exacto de muestras de control dependerá de la configuración experimental del usuario. Ver la discusión para más detalles. </li></ol> 5. Análisis de imágenes NOTA: El análisis de imagen se realiza en ImageJ 45 y utiliza la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, proporcionada como un archivo suplementario. <ol><li> Coloque todas las imágenes a analizar en la misma carpeta. </li><li> Inicie ImageJ y ejecute la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; haciendo clic en &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Ejecutar&quot;, seleccionando &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; en el explorador de archivos y haciendo clic en &quot;abierto.&quot; NOTA: Todos los pasos siguientes se encuentran dentro de la macro. Cada paso es un comando macro individual. </li><li> Tenga en cuenta que se abre un cuadro de diálogo &quot;Acción necesaria&quot;, indicando &quot;Elegir la carpeta donde se almacenan las imágenes&quot;. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; y utilice el explorador de archivos para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes y luego haga clic en &quot;elegir&quot;. </li><li> Tenga en cuenta que un cuadro de diálogo &quot;Acción necesaria&quot; se abrirá, indicando &quot;Elegir la carpeta donde desea que los datos se almacenen.&quot; Haga clic en &quot;Aceptar&quot; y utilice el explorador de archivos para seleccionar la carpeta deseada para guardar los perfiles de pigmentación. Haga clic en &quot;elegir&quot;. </li><li> Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo preguntando &quot;¿Cuántos caracteres tiene su ID de muestra?&quot; En el cuadro de entrada de datos, ingrese el número de caracteres en [SampleID], como se especifica en el paso 3.3, y haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Tenga en cuenta que un cuadro de diálogo se abrirá, preguntando &quot;¿Qué tan grande es su ROI?&quot; En el cuadro de entrada de datos, ingrese el ancho de píxeles del ancho anterior-Posterior a lo largo de la cual se debe leer el perfil de pigmentación (rectángulo verde, figura 1G , figuras 2A y 2A &#39;). Haga clic en Aceptar;&quot; El valor predeterminado es 20 píxeles. NOTA: El perfil de pigmentación se lee a través de una tira de cutícula, en lugar de una línea, para reducir el ruido debido a pelos y cerdas. El ancho de esta tira dependerá de la resolución de la imagen, pero debe ser ~ 1/20 de la anchura del abdomen, en píxeles. </li><li> Tenga en cuenta que la macro abrirá la imagen de la primera mosca y un cuadro de diálogo le preguntará si desea medir la mosca actual (haga clic en &quot;Sí&quot;), para pasar a la siguiente mosca (haga clic en &quot;No&quot;) o para salir Macro (haga clic en &quot;Cancelar&quot;). </li><li> Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo que indicará &quot;Definir la línea media del abdomen dorsal, de ANTERIOR a POSTERIOR&quot;. La herramienta &quot;línea recta&quot; ya estará seleccionada. Dibujar una línea desde anterior a posteriorPara definir la línea media del abdomen dorsal. Haga clic en Aceptar;&quot; Ver Figura 2A y 2A &#39;, línea amarilla. NOTA: Se utiliza para reorientar la imagen de manera que la línea media dorsal se encuentre horizontalmente a través de la pantalla, con la anterior a la izquierda, facilitando los siguientes pasos. </li><li> Tenga en cuenta que se abrirá un cuadro de diálogo que indicará &quot;Definir el borde POSTERIOR de Tergite 4 justo detrás de la banda de pigmentos&quot;. La herramienta &quot;línea recta&quot; ya estará seleccionada. Dibuje una línea desde el borde de la línea media posterior hasta el borde lateral derecho, de manera que el centro de la línea (marcado con un cuadrado blanco) se sitúe justo posterior al borde posterior de la banda de pigmento (cutícula a5). Haga clic en Aceptar;&quot;. Ver la Figura 2A y 2A &#39;, línea magenta. NOTA: El script R detectará automáticamente el borde posterior de la banda de pigmento del perfil de pigmentación. </li><li> Tenga en cuenta que un diálogoLa caja se abrirá, indicando &quot;Defina el borde ANTERIOR de Tergite 4 en el borde anterior de la cutícula pigmentada (a2)&quot;. La herramienta &quot;línea recta&quot; ya estará seleccionada. Dibuje una línea desde el borde de la línea media anterior hasta el borde lateral derecho, de manera que el centro de la línea (marcado con un cuadrado blanco) se sitúe en el borde anterior de la cutícula pigmentada (cutícula a2). Haga clic en Aceptar;&quot;. Véase la figura 2A y 2A &#39; , línea cian. NOTA: El script R definirá este punto como el borde anterior de la cutícula pigmentada del tergito. En la imagen, la macro mostrará la región de interés (ROI) a lo largo de la cual se lee el perfil de pigmentación (rectángulo verde, figura 2A y 2A &#39;, ampliada en las figuras 2B y 2B &#39;). La macro también abrirá una segunda ventana que muestra el perfil de pigmentación para el ROI ( Figur<html> E 2C y 2C &#39;), donde el eje x es la posición, expresada como el número de píxeles desde el borde posterior del perfil, y el eje y es el valor medio del píxel en cada posición. </li><li> Ver las gráficas del perfil de pigmentación que será abierto por la macro. Si es necesario, haga clic en &quot;Live&quot; en la ventana de perfil para ajustar la posición del ROI de modo que no incluya estructuras ( por ejemplo, cerdas) que influirían en el perfil de pigmentación. Una vez que el perfil es satisfactorio, haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Repita los pasos 5.8-5.11 para Tergite 3. NOTA: La macro luego exporta los perfiles de pigmentación como dos archivos CSV, cada uno denominado &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;, donde [SESH000_samplename] es el nombre de la imagen y [TX] es T3 o T4 para el tercero y el cuarto tergites, respectivamente. </li><li> Tenga en cuenta que la macro abre la siguiente imagen. Repita los pasos 5.7-5.13 hasta que todas las imágenes hayan sido analizadas. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Preprocesamiento de datos, análisis y corrección de sesión NOTA: Todo el análisis de datos se lleva a cabo en R 47 y utiliza el script &quot;Análisis de Pigmentación.R&quot; proporcionado. A continuación, &quot;L ...&quot; indica qué línea (s) del script debe ejecutarse para cada parte del análisis. Consulte la información suplementaria para obtener detalles adicionales sobre cómo se realiza el análisis. <ol><li> Edite la secuencia de comandos R para establecer el directorio de trabajo (L6) y defina la ruta de acceso a la carpeta que contiene los perfiles .csv (L11). </li><li> Ejecute L13-15 para generar una lista de los perfiles de pigmentación almacenados en la carpeta de perfiles. </li><li> Cargue y ejecute las funciones &quot;reader&quot; y &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41) para leer los perfiles en un único marco de datos. </li><li> Edite el script en L43 para especificar la calibración espacial de las imágenes en μm / píxeles, como se determina en el paso 2.5. </li><li> Cargue y ejecute el ajuste(L46-58) para convertir la posición del perfil (eje x, figura 2C y 2C &#39;) desde píxeles desde el borde posterior del ROI hasta μm desde el borde anterior del ROI y (0 = negro, 255 = blanco) al valor de pigmentación (0 = sin pigmento, 255 = pigmento máximo). </li><li> Cargar y ejecutar la función &quot;spline.der.er&quot; (L60-71) para generar la spline cúbica de los perfiles de pigmentación y sus derivadas primera y segunda ( Figura 2D -2F y 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Cargar y ejecutar las funciones &quot;coord&quot; y &quot;assmbly.coord&quot; (L74-163), primero para extraer la posición de los bordes posterior (T 3 ) y anterior (T 2 ) de la banda de pigmento ( Figura 2D y 2D &#39;Y el borde posterior de la cutícula a2 (T1, Figura 2D y 2D &#39;), y luego extraer los valores de pigmentación máximos (Pmáx) y mínimos (P min ), tomados en T3 y T1, respectivamente. NOTA: El borde anterior de la cutícula a2 ya se ha definido en el paso 5.9. </li><li> Opcional: Cargue y ejecute la función &quot;chek&quot; (L165-175) para comprobar si la función &quot;coord&quot; identifica correctamente las posiciones T 1-3 para un perfil de pigmentación seleccionado al azar. </li><li> Cargar y ejecutar las funciones de índice y métricas (L178-193) para generar una tabla de datos con los encabezados &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (una concatenación de Sample y Tergite), &quot;Pmax&quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (anchura de la banda de pigmento, = T3 - T 2 ), y &quot;W tergite &quot; (anchura de la pigmentada cA2-a5, = T3). </li><li> Cargue y ejecute la función &quot;corrección&quot; (L196-234) para generar una tabla de datos que corrija Pmax y Pmin para cualquier factor de perturbación que surja debido a los efectos de sesión. Utilice el aumento (o disminución) promedio en Pmax o Pmin de las muestras de control reimaginadas en sesiones temporalmente adyacentes. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta metodología permite la adquisición precisa, rápida y repetible de datos de pigmentación en una forma cuantitativa adecuada para múltiples análisis posteriores. El método se ha utilizado para obtener datos sobre el efecto de la temperatura en la pigmentación abdominal en una línea isogénica de moscas. Sin embargo, la metodología podría utilizarse en estudios de genética avanzada para identificar genes que subyacen en las diferencias de pigmentación entre individuos, poblaciones o especies, o estudios g...

La pigmentación muestra una enorme variación fenotípica entre especies, poblaciones e individuos, e incluso dentro de individuos durante la ontogenia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Aunque hay una gran cantidad de estudios de pigmentación en una amplia variedad de animales, la pigmentación ha sido quizás mejor estudiada en Drosophila melanogaster , donde la potencia total de la genética molecular se ha utilizado para dilucidar los mecanismos de desarrollo y fisiológicos que regulan la pigmentación y cómo estos mecanismos evolucionan 1 , 6 . Mucho se sabe sobre los genes que regulan la síntesis bioquímica de pigmentos en D. melanogaster 7 , 8 y los genes que controlan el di temporal y espacialDistribución de esta biosíntesis 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Además, la cartografía genética ha identificado los loci genéticos subyacentes intra e interespecíficos diferencias en la pigmentación en D. melanogaster [ 14 , 15 , 16 , 17] . Las relaciones entre la pigmentación y rasgos pleiotrópicos, como el comportamiento 18 , 19 y la inmunidad 19 , 20 , también han sido explorados, al igual que la importancia adaptativa de los patrones de pigmentación [ 15 , 21 , 22] . Como tal, la pigmentación en D. melanogaster ha surgido como un poderoso pero simple mPara el desarrollo y la evolución de fenotipos complejos. La pigmentación en adultos de D. melanogaster se caracteriza por distintos patrones de melanización en todo el cuerpo, particularmente en las alas y el tórax dorsal y el abdomen. Es la pigmentación de cada placa cuticular (tergita) en el abdomen dorsal, sin embargo, que ha recibido la mayor atención de la investigación. Hay una variación considerable en esta pigmentación ( Figura 1A- F ), debido a la genética 17 , 23 y el medio ambiente 24 , 25 factores. La cutícula de un tergito abdominal está formada por compartimentos de desarrollo anteriores y posteriores ( Figura 1G ), cada uno de los cuales puede subdividirse dependiendo de la pigmentación y la ornamentación 26 . El compartimiento anterior incluye seis cutículas(A1-a6), y el compartimento posterior incluye tres (p1-p3) ( Figura 1G ). De éstos, la cutícula p1, p2 y a1 se pliega típicamente debajo del tergite en abdómenes no estirados de modo que estén ocultados. La cutícula confiablemente visible se caracteriza por una banda de pigmentación pesada, denominada aquí &quot;banda pigmentaria&quot;, compuesta por tipos de cutícula a4 (peludos con cerdas moderadas) y a5 (peludos con cerdas grandes), con el borde posterior de la banda Más intensamente pigmentado que el borde anterior ( Figura 1G ). Anterior a esta banda es una región de cutícula peluda ligeramente pigmentada, que tiene cerdas posteriores (a3) ​​pero no anterior (a2). La variación en la pigmentación entre las moscas se observa tanto en la intensidad de la pigmentación como en el ancho de la banda de pigmento. En general, la variación es mayor en los segmentos más posteriores (segmentos abdominales 5, 6 y 7) y es más baja en los segmentos más3 y 4) 24 . Además, hay un dimorfismo sexual en la pigmentación de D. melanogaster , con los varones que generalmente tienen tergitos abdominales quinto y sexto completamente pigmentados ( Figura 4C ). En la mayoría de los estudios de pigmentación abdominal en D. melanogaster , la pigmentación ha sido tratada como un rasgo categórico u ordinario, con el patrón medido cualitativamente 27 , 28 , 29 o semi-cuantitativamente en una escala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Estos métodos sufren inevitablemente de una falta de precisión, y porque se basan en la evaluación subjetiva de la pigmentación, es difícil comparar los datos entre los estudios. Varios autores han cuantificado las dimensiones espaciales de la pigmentación 38 , 39 , la intensidad de la pigmentación de una determinada cutícula tipo 23 , 25 , 39 , 40 , o la intensidad media de la pigmentación a través del tergito abdominal en su conjunto 41 , 42 , 43 . Sin embargo, estos métodos de cuantificación no miden simultáneamente la intensidad y la distribución espacial de la pigmentación abdominal y por lo tanto no capturan los matices de cómo la pigmentación varía a través del abdTergite ominal Además, varios de estos métodos de cuantificación 38 , 41 , 42 , 43 requieren la disección y el montaje de la cutícula abdominal. Esto es tanto tiempo y destruye la muestra, por lo que no está disponible para los análisis morfológicos adicionales. A medida que se profundice la comprensión del desarrollo y la evolución de la pigmentación abdominal, se necesitarán herramientas más sofisticadas para medir con rapidez y precisión tanto la distribución espacial como la intensidad de la pigmentación. El objetivo general de este método es utilizar el análisis de imágenes digitales para obtener una medida replicable y más precisa de la pigmentación abdominal en D. melanogaster . La metodología incluye tres etapas. En primer lugar, la mosca del adulto no se monta destructivamente, y se toma una imagen digital del abdomen dorsal. Segundo, usando una macro ImageJ, el usuarioDefine una franja antero-posterior de píxeles que se extiende desde la parte anterior de la cutícula a2 hasta la parte posterior de la cutícula a5 (caja verde, Figura 1G ) en el tercer y cuarto segmentos abdominales. El valor medio del píxel a través del ancho de esta tira se extrae entonces a lo largo de su eje largo, generando un perfil que captura la distribución espacial y la intensidad de la pigmentación a medida que cambia de la anterior a la posterior del tergito. En tercer lugar, un script R se utiliza para describir matemáticamente el perfil de pigmentación usando una spline cúbica. La secuencia R utiliza entonces la spline y su primera y segunda derivada para extraer el ancho de la cutícula a2-a5, el ancho de la banda de pigmento y los niveles máximo y mínimo de pigmentación. Por lo tanto, el método cuantifica tanto las características espaciales como la profundidad de la pigmentación abdominal. Esta metodología cuantifica la pigmentación de los tercero y cuarto tergitos abdominales,Que han sido el foco de numerosos estudios anteriores 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ya sea exclusivamente o en combinación con tergitos más posteriores. Aunque son menos variables que los tergitos quinto y sexto abdominal, los tercero y cuarto tergitos no están completamente pigmentados en varones, por lo que este protocolo puede aplicarse tanto a hombres como a mujeres. Sin embargo, como se muestra aquí, el protocolo se puede utilizar para medir la pigmentación en el quinto y sexto tergites abdominales en las mujeres. Además, modificaciones menores de los guiones utilizados para extraer las características del perfil de pigmentación deberían permitir que el método se utilice para cuantificar la variación en la pigmentación en una amplia variedad de otrosMicroorganismos.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biology Forceps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gooseneck Cold Light Source</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Control Software</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

La pigmentación es un rasgo morfológicamente simple pero altamente variable que a menudo tiene significación adaptativa. Ha servido extensamente como un modelo para entender el desarrollo y la evolución de fenotipos morfológicos. La pigmentación abdominal en Drosophila melanogaster ha sido particularmente útil, permitiendo a los investigadores identificar los loci que subyacen a las variaciones inter y intraespecíficas de la morfología. Hasta ahora, sin embargo, la pigmentación abdominal de D. melanogaster ha sido ampliamente ensayada cualitativamente, a través de la puntuación, más que cuantitativamente, lo que limita las formas de análisis estadístico que se pueden aplicar a los datos de pigmentación. Este trabajo describe una nueva metodología que permite la cuantificación de varios aspectos del patrón de pigmentación abdominal del adulto D. melanogaster . El protocolo incluye montaje de especímenes, captura de imágenes, extracción de datos y análisis. Todo el software utilizado para capturar imágenes y macros de características de análisisEscrito para el análisis de imágenes de código abierto. La ventaja de este enfoque es la capacidad de medir con precisión los rasgos de pigmentación usando una metodología que es altamente reproducible a través de diferentes sistemas de imagen. Aunque la técnica se ha utilizado para medir la variación en los patrones de pigmentación tergal de D. melanogaster adulto, la metodología es flexible y ampliamente aplicable a patrones de pigmentación en una miríada de organismos diferentes.

El protocolo se utilizó para explorar el efecto de la temperatura de cría en la pigmentación abdominal. Estudios anteriores han demostrado que un aumento en la temperatura de desarrollo da lugar a una disminución de la propagación de la pigmentación abdominal en varias especies de Drosophila , incluyendo D. melanogaster 30 , 32 . Específicamente, en los tergitos abdominales 3 y 4, el grado de pigmentació...

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K vistas.  Lake Forest College.  Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos. 

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A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Investigación

Genética

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Neurociencias

<meta charset="utf8"></head><body>Cuantificación imparcial de omatidios en modelos oculares de Drosophila

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal pattern. This regularity and ease of observation make the Drosophila eye system a powerful tool to model various human neurodegenerative diseases. However, ways of quantifying abnormal phenotypes, such as manual ranking of eye severity scores, have limitations, especially when ranking weak alterations in eye morphology. To overcome these limitations, computational approaches have been developed such as Flynotyper. The use of a ring light allows for better qualitative images accessing the intactness of individual ommatidia. However, these images cannot be analyzed by Flynotyper directly due to shadows on ommatidia introduced by the ring light. Here, we describe an unbiased way to quantify rough eye phenotypes observed in Drosophila disease models by combining two software, ilastik and Flynotyper. By preprocessing the images with ilastik, successful quantification of the rough eye phenotype can be achieved with Flynotyper.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Cuantificación de fenotipos de ojos ásperos en modelos de Drosophila de esclerosis lateral amiotrófica con demencia frontotemporal

The Drosophila eye system is a useful tool for studying various biological processes, particularly human neurodegenerative diseases. However, manual quantification of rough eye phenotypes can be biased and unreliable. Here we describe a method by which ilastik and Flynotyper are used to quantify eye phenotype in an unbiased way.

Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Biología del Desarrollo

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biología

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Métodos para pupa períodos de prueba y medición de pigmentación de ala de Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en

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Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila

Teñido Insectos de la Conducta ensayos: el comportamiento de apareamiento de anestesiada

Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

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Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

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