Name: precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Queremos agradecer al Dr. Iain Drummond y al Dr. Vladimir Korzh por compartir líneas transgénicas GFP de riñón. También queremos agradecer a NYITCOM por proporcionar los recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo. Este estudio fue en parte apoyado por subvenciones: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), y la subvención piloto HSCI (AV).

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Colegio de Medicina de Osteopatía de NYIT Instituto de Cuidado de Animales y Comité de Uso (NYITCOM IACUC). Toda la cirugía y la experimentación in vivo se realizó bajo anestesia con tricaína, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. 1. Obtención y mantenimiento de embriones <ol><li> Obtener embriones cruzando el riñón GFP fluorescente pez cebra. NOTA: Los ejemplos de líneas transgénicas de pez cebra marcadas fluorescentemente se enumeran en la Tabla 1 . </li><li> Mantener los embriones a 28,5 ° C en solución de E3 durante las 24 h posteriores a la fecundación. </li><li> Después de 24 h, sustituir el medio con una solución de E3 que contiene 0,003% de 1-fenil-2-tiourea (PTU). NOTA: La PTU se utiliza porque bloquea los pasos dependientes de la tirosinasa en la melanogénesisY por lo tanto previene la pigmentación. Aquí, esta solución se conoce como E3-PTU. </li><li> Elevar los embriones fertilizados a 28,5 ° C hasta que son&gt; 6 dpf, momento en el que los riñones han madurado. NOTA: Lo mejor es utilizar larvas en la ventana 7-9 dpf. </li><li> Utilizando un microscopio de disección fluorescente con un aumento de 40X y filtros de emisión de fluorescencia verde, seleccione las larvas con fluorescencia brillante de GFP en el riñón. </li></ol> 2. Montaje del Zebrafish para Live-imaging <ol><li> Si fotoablating los embriones antes de 3 dpf, quitar el chorion de cualquier pez cebra sin sombrear antes de montar el pez cebra para la formación de imágenes. <ol><li> Manualmente dechorinate con fórceps (preferido) o utilizar un tratamiento químico con una mezcla de proteasa. NOTA: Dechorination permite obtener los mejores resultados de imagen. </li></ol></li><li> Enjuague los restos de corión en la placa de petri usando la solución E3-PTU y rellene el plato con E3-PTU. </li><li> PrepaL 1-2% de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) con solución de tricaína 0,2 mg / ml para montar el pez cebra para la fotoablación renal y la imagen en vivo. <ol><li> Si la agarosa LMP ya estaba preparada de antemano, recaliéntela en el microondas para derretirla. </li></ol></li><li> Una vez que se prepara la agarosa LMP, coloque una placa de Petri de plástico de 35 mm en un microscopio de disección. Coloque una sonda de vidrio tirado cerca para orientar adecuadamente las larvas anestesiadas. NOTA: Es importante hacer este paso de manera oportuna y tener todo en su lugar, porque los embriones deben orientarse antes de que la agarosa se solidifique en aproximadamente 1-3 minutos. </li><li> Antes de transferir el embrión a la agarosa, asegúrese de que la agarosa esté fría ( es decir , aproximadamente a la temperatura corporal). Utilice una pipeta de transferencia de plástico o vidrio para colocar el embrión en la solución de agarosa-tricaína fundida enfriada. NOTA: Esto se hace porque la agarosa que es demasiado caliente puede ser perjudicial para el embrión, lo que lleva a un paro cardiacoO muerte </li><li> Usando una pipeta de transferencia, vuelva a dibujar el embrión en la solución de agarosa y coloque el embrión / larva en medio de un plato de 35 mm. </li><li> Esparcir rápidamente la agarosa que contiene el embrión / larva para cubrir uniformemente el fondo del plato de 35 mm; El mejor volumen de agarosa para usar es de ~ 1-1,1 mL. </li><li> Utilice la sonda de vidrio para orientar el embrión en la mejor posición posible para la fotoablación y la obtención de imágenes. NOTA: La película 1 muestra la mejor orientación del embrión / larva para la fotoablación unilateral. Este paso es el más sensible al tiempo y debe realizarse rápidamente antes de que la agarosa comience a gelificarse, ya que cualquier intento de reorientar el pescado después de que comience la gelificación es perjudicial. <ol><li> Oriente la larva para que el segmento de riñón de interés sea perpendicular a la trayectoria del haz, mientras que el segmento contralateral está alejado del rayo láser (ver Película 1 ). NOTA: Esto se puede lograr girando la larva como se muestra en la Película 1 . </lI&gt; </ol></li><li> Deje unos 15 minutos para que la agarosa se solidifique. Cubrir la placa de Petri para minimizar la evaporación. Una vez que la agarosa se ha solidificado, el embrión o larva está listo para la fotoablación. </li></ol> 3. Ablación láser <ol><li> Operar el sistema de imágenes confocal. NOTA: Cuando se utiliza la plataforma de imágenes referenciada (ver tabla de materiales), los ajustes recomendados incluyen una ampliación de 40X, una lente de inmersión de 0,8 NA y el primer conjunto de espejo dicroico para permitir la iluminación de 488 y 405 nm de la muestra. La detección debe realizarse en el canal verde. </li><li> Coloque el plato que contiene el pez cebra inmovilizado en una etapa confocal. NOTA: Este procedimiento se optimiza para la configuración vertical usando una lente de inmersión de agua 40-60X. Sin embargo, debería ser posible modificar el procedimiento para un microscopio invertido. </li><li> En la configuración vertical, coloque la placa de Petri que contiene el embrión en la parte superior de un microscOpe la diapositiva y manténgala en su lugar utilizando arcilla de modelado ( por ejemplo, plastilina). Coloque el portaobjetos de vidrio con la placa de Petri sobre el escenario del microscopio confocal. </li><li> Añadir 3 ml de la solución de formación de imágenes E3-PTU (ver paso 1.3) con 0,2 mg / ml de tricaína. NOTA: La solución de imagen también se puede añadir inmediatamente antes de colocar la diapositiva en el escenario. La adición de la solución de la proyección de imagen se debe hacer muy cuidadosamente para evitar que la agarosa flote de la parte inferior del plato. </li><li> Cambie a la lente de inmersión de agua (40 o 60X). Levante lentamente la platina, asegurándose de que la lente esté ligeramente inclinada para evitar que el aire quede atrapado en la trayectoria del haz. Una vez que el objetivo toca la solución en un ángulo, el centro de manera que se encuentra en el campo de visión de los embriones. </li><li> Encuentre el segmento de interés usando la fuente de luz de fluorescencia. Posicione superficialmente la rama dirigida a la lesión para minimizar la dispersión de la luz (vea Película 1 ). NOTA: El subsequenT pasos hacen uso de software referenciado (ver la Tabla de Materiales), pero el procedimiento puede ser fácilmente adaptado a otras plataformas. </li><li> Abra el software. Navegue hasta &quot;Ver&quot; | &quot;Control de Adquisición&quot; | &quot;C2plus Compact GUI&quot; y establecer &quot;tiempo de permanencia de píxeles&quot; a &quot;1,9 μs&quot;, &quot;tamaño de marco&quot; a &quot;512 x 512 píxeles&quot; y &quot;tamaño de pinhole&quot; a &quot;90 μm&quot;. Ajuste &quot;intensidad láser de 405 nm (o 408 nm en algunos sistemas)&quot; a cero y &quot;intensidad láser 488&quot; a &quot;baja&quot; (preferiblemente &lt;1%). Ajuste la &quot;ganancia&quot; para obtener un buen rango dinámico pero no para saturar la señal. NOTA: Estos valores no son críticos y se utilizan para la coherencia. Cuando se utiliza un láser de 405 nm, resultará en aumentos en la fluorescencia GFP. Para evitar la saturación de la señal durante el fotoblanqueo (paso 3.11), el valor de ganancia de la señal debe reducirse en el canal verde. La ganancia de canal azul se puede dejar en cero, ya que no se utiliza para saMpling </li><li> Haga clic en &quot;Escanear&quot; en la interfaz de software para escanear el riñón usando un láser de 488 nm. Encuentre el segmento de interés que es perpendicular a la trayectoria del haz y que está bien visualizado, con buena fluorescencia GFP. Una vez que esa región ha sido identificada, dibuje una región de interés usando una región de interés (ROI) elíptica. <ol><li> Navegar hasta &quot;ROI&quot; | &quot;Dibuja ROI elíptico.&quot; NOTA: Esto se usará para medir continuamente la intensidad promedio de GFP mientras se lleva a cabo el fotoblanqueo, permitiendo la administración de una dosis precisa de tratamiento con láser. </li></ol></li><li> Navegue hasta &quot;Ver&quot; | &quot;Controles de adquisición&quot; | &quot;Área de escaneo C2plus&quot; y seleccione &quot;Área de exploración de banda&quot;. La máscara rectangular aparecerá dentro de esa interfaz. Defina manualmente una ventana de exploración rectangular con el cursor ( es decir , arrastrar, cambiar el tamaño y girar la máscara) para cubrir el segmento dirigido para la ablación con láser. Haga clic con el botón derecho en elZona de máscara para aceptar la selección. NOTA: Sólo se escaneará la región seleccionada. </li><li> Comience la medición del tiempo mientras monitoriza el canal verde utilizando sólo el láser de 488 nm para activar GFP. Asegúrese de que la intensidad del láser 488 es relativamente baja (~ 1%). Medir la intensidad media de la GFP en la región de interés seleccionando &quot;Measure&quot; | &quot;Medición del tiempo&quot;. Utilice las fichas &quot;Gráfico&quot; o &quot;Datos&quot; para supervisar los valores de intensidad media dentro del ROI. NOTA: La velocidad de adquisición se define por el tiempo de permanencia de los píxeles y el tamaño de la ventana rectangular establecida en el paso 3.9, pero en general, permite la supervisión rápida de la señal (~ 2-10 cuadros / s). </li><li> Inducir daño a las células del riñón con el láser violeta (405 nm) aumentando la intensidad al 100% deslizando el control de la &quot;potencia del láser&quot; completamente a la derecha. El láser de 488 nm puede permanecer activo si la intensidad es baja. <ol><li> Observe una línea gUsando la pestaña &quot;Gráfico&quot; o los valores numéricos de la intensidad GFP usando la pestaña &quot;Datos&quot; y esperar hasta que caiga a un nivel deseado, por ejemplo 50% de la línea base (como se muestra en la Figura 1 ). NOTA: Se ha utilizado un láser de 20 mW como parte de la unidad láser referenciada (ver la Tabla de Materiales ); La intensidad máxima puede variar entre los sistemas. Una intensidad más baja puede ser compensada por una exposición más prolongada ( es decir, usando el porcentaje de blanqueo GFP como una medida de la exposición total). </li></ol></li><li> Una vez que la intensidad GFP dentro del ROI elíptico (paso 3.8) ha bajado a un nivel deseado, disminuya inmediatamente la intensidad del láser violeta (405 nm) a &quot;0&quot; moviendo el control deslizante de &quot;potencia láser&quot; completamente a la izquierda en El panel de control del software. <ol><li> Obtener una nueva línea base de fluorescencia GFP. Confirme la ablación obteniendo una relación de X / Y. NOTA: Vea la Figura1B; Y = intensidad media antes de la ablación y X = intensidad media después de la ablación, utilizando un promedio de 4 muestras consecutivas dentro del ROI. La proporción objetivo exacta (50%, 60%, etc. ) depende de la cantidad de lesión que se desea para un experimento dado. </li></ol></li></ol> 4. Microscopía de lapso de tiempo con tinción con yoduro de propidio <ol><li> Aplique consideraciones generales de lapso de tiempo (resumidas en un estudio previo 15 ) para visualizar la tinción con yoduro de propidio como un correlato de la lesión de células renales después de la fotoablación. </li><li> Pre-incubar las larvas en 30 μ M solución de yoduro de propidio (1% DMSO en E3-PTU) durante 3 h antes de la incorporación y fotoablación, como se describe en los pasos 2 y 3.7, respectivamente. NOTA: No se requiere más yoduro de propidio en la agarosa o en la solución de formación de imágenes. </li><li> Inducir lesión renal segmentaria, como se describe en los pasos 3.1-3.12. </li><li> Obtener pilas de imágenes de lapso de tiempo, según descriEn un estudio previo 14 , utilizando un láser de 488 nm (GFP) y un láser de 461 nm (Propidium Iodide, PI). NOTA: Los dos colores se superponen en pilas confocales para correlacionar la desaparición de GFP y la aparición de tinción con yoduro de propidio. </li><li> Establezca los parámetros para obtener las pilas de imágenes de lapso de tiempo de la siguiente manera: espesor de rebanada virtual = 4 μm, intervalo de pila z = 2 μm, tiempo de permanencia de pixel = 1,9 μs, dimensiones de imagen = 512 x 512 y promediado = 2. NOTA: Estos parámetros permiten el registro continuo de intervalos de hasta 10 a 15 minutos de hasta 4 larvas y aseguran que haya un fotoblanqueo mínimo de la muestra. </li><li> Utilice software de imagen compatible con el formato de archivo de grabación para visualizar y analizar los datos. </li></ol>

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	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Cabe señalar que la potencia total del láser varía entre sistemas. Sin embargo, el porcentaje de fotoblanqueo GFP permite una lectura de la energía total entregada al riñón fluorescente, independientemente de la variación en la potencia láser y compensada por la duración de la exposición. Tenga en cuenta, sin embargo, que la respuesta de los diferentes tejidos a este método de fotoablación varía. Incluso durante la maduración del riñón, es significativamente más difícil obtener una reducción del 50% e...

La lesión aguda del riñón 1 , 2 , que también se puede denominar insuficiencia renal aguda, se define ampliamente como una alteración súbita de la función renal 3 . Mientras que el nivel de comprensión de esta condición se ha mejorado notablemente en los últimos años, las tasas de morbilidad y mortalidad se han mantenido altas 1 , 2 . El tratamiento actual para esta condición es en su mayoría de apoyo, ya que los resultados de múltiples ensayos clínicos de la terapia de drogas han sido negativos 4 , 5 . El riñón es único en que tiene la capacidad de repararse. Por lo tanto, la terapia de apoyo después de un diagnóstico precoz de la IRA es la mejor manera de limitar la morbilidad 6 . Sin embargo, es difícil detectar la LRA tempranamente, y la tasa de mortalidad es sorprendente en un 50-80% para aquellos que requieren diálisis 5. Con la capacidad de los riñones para repararse y la falta de opciones de tratamiento para esta condición, es importante desarrollar métodos para mejorar este proceso de regeneración de nefrón. Ha habido muchos modelos diferentes utilizados para la investigación de AKI que incluye diferentes agentes de lesiones y modelos animales. En términos de agentes de daño renal, el aminoglucósido antibiótico gentamicina se ha utilizado como un agente nefrotóxico que conduce a AKI 7 , 8 . Sin embargo, varios grupos han encontrado que el tratamiento con gentamicina es letal para el embrión de pez cebra 9 . Provoca daños tubulares que son demasiado graves para la recuperación del embrión, haciendo difícil el estudio de la regeneración sin algún tipo de intervención. Los modelos de mamíferos, como el ratón y la rata, también se consideran valiosos, pero se enfrentan a muchas limitaciones durante el estudio de la LRA. Tal vez la principal desventaja de los modelos de roedores es la dificultad en visuaDeterminando así los procesos espaciotemporales precisos que conducen a la muerte y reparación epiteliales. Johnson et al. Han informado de una técnica basada en la ablación con láser para inducir una lesión renal aguda en el pez cebra embrionario y larval 9 . Utilizaron la ablación láser pulsada para dañar el riñón después de una inyección intramuscular con conjugados de dextrano. La fluorescencia de los conjugados dextrano permite la visualización del daño y la regeneración en el epitelio de los túbulos [ 9] . Este modelo supera las dos limitaciones mencionadas anteriormente, pero no permite niveles graduados de lesión y es difícil de llevar a cabo en grandes grupos de células arbitrarias. El nuevo modelo basado en la ablación láser de pez cebra de AKI descrito aquí se ocupa de todas las limitaciones anteriores. El riñón proneférico en el pez cebra larvario es un órgano maduro y funcional que contiene segmentos similares a los mamíferos nePhron, incluyendo un glomérulo, túbulos proximal y distal, y un conducto colector 10 . Las larvas de pez cebra también son ópticamente transparentes, lo que hace factible observar el riñón a través de técnicas de fluorescencia. Por lo tanto, el pez cebra es un valioso modelo in vivo de IRA, y el riñón pronefrico larvario (5-12 días después de la fecundación (dpf)) puede ser usado para estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la lesión renal y la reparación. Este artículo presenta un método a través del cual los segmentos de nefrona que expresan la Proteína Fluorescente Verde (GFP) específica pueden ser fotoablados usando una luz láser violeta de baja energía (en comparación con un sistema de láser pulsado) (405 nm). La fluorescencia GFP permite la orientación de un grupo de células, haciendo que los cambios que se hacen visibles a través de la observación de GFP photobleaching. Además, la GFP (mediante la absorción de luz violeta) sirve como un sumidero de energía para potenciar la lesión en células renales que expresan GFP. Micros de lapso de tiempoCopia se puede utilizar para estudiar el proceso de reparación. Los estudios han encontrado que la proliferación celular, la migración celular y la metaplasia celular 11 , 12 , 13 son procesos potenciales que pueden desempeñar un papel importante en la reparación renal. Sin embargo, la importancia relativa de estos procesos y los detalles de su interacción han sido difíciles de descubrir debido a las limitaciones de los modelos existentes de AKI. Utilizando este nuevo enfoque, fue posible demostrar que la migración celular desempeña un papel central en la reparación renal después de una lesión aguda [ 14] .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

La lesión aguda del riñón (LRA) es una condición médica común con una alta tasa de mortalidad. Con las habilidades de reparación del riñón, es posible restaurar la función renal adecuada después del tratamiento de apoyo. Sin embargo, se necesita una mejor comprensión de cómo la muerte y la reparación de las células nefronas ocurren a nivel celular para minimizar la muerte celular y mejorar el proceso regenerativo. El pronefros del pez cebra es un buen sistema modelo para lograr este objetivo porque contiene segmentos anatómicos que son similares al nefrón de mamíferos. Anteriormente, el modelo más común utilizado para estudiar la lesión renal en los peces era el modelo farmacológico de la gentamicina. Sin embargo, este modelo no permite un control espaciotemporal preciso de la lesión, por lo que es difícil estudiar los procesos celulares y moleculares involucrados en la reparación renal. Para superar esta limitación, este trabajo presenta un método a través del cual, en contraste con el enfoque de gentamicina, una proteína verde fluorescente específica (GFP) -exEl prensado del segmento nefrón puede ser fotoablado usando una luz láser violeta (405 nm). Este nuevo modelo de AKI proporciona muchas ventajas que otros métodos de lesión epitelial carecen. Sus principales ventajas son la capacidad de &quot;marcar&quot; el nivel de lesión y el control espaciotemporal preciso en el robusto modelo animal in vivo . Este nuevo método tiene el potencial de avanzar significativamente el nivel de comprensión de la lesión renal y los mecanismos de reparación.

Tenga en cuenta que este protocolo se utilizó con éxito con un número de líneas transgénicas GFP renal, incluyendo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 y Tg (atp1a1a.4: GFP). Los resultados de ejemplo mostrados aquí se obtuvieron usando la línea sqet11-9 de ET (krt8: EGFP). La Figura 1 muestra el ejemplo del protocolo de fotoabla- ción. La intensidad media de GFP se monitor...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.

Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K vistas.  NYITCOM.  Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biología

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Microinyección intravenosa de nefrotoxinas en embrión de pez cebra: una técnica para administrar agentes nefrotóxicos en el torrente sanguíneo de un embrión de pez cebra

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...