The authors thank M. Gordon of the Queen's University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).

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The authors have nothing to disclose.

Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC 8, 9 para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes animales, MC es inerte, no contiene factores de crecimiento, y se elimina fácilmente por lavado, lo que permite el aislamiento de esferoides para su uso en una variedad de aplicaciones sin la presencia de la matriz residual. Nuestro protocolo utiliza una agregación rápida del número de células consistentes para generar esferoides homogénea de tamaño, lo que permite comparaciones directas de esferoides cultivadas bajo diferentes condiciones experimentales. Este método puede ser adaptado para cultivos mixtos de modelar en el crecimiento tumoral in vivo mediante la combinación de números fijos de múltiples tipos de células asociados a tumores (por ejemplo, fibroblastos, leucocitos, células estromales) para representar con mayor precisión el ambiente del tumor. Las modificaciones de nuestras células de protocolo usando sembradas en altas concentraciones de MC se pueden hacer para controlar el crecimiento independiente de anclaje de células capaces de proliferar en suspensión, y pueden emplearse como un ensayo anoikis (Sección 6) para identificar o cuantificar la transformación celular. Esferoides generados por nuestro protocolo son ideales para aplicaciones tales como la detección de drogas, lo que permite la comparación del crecimiento celular, el metabolismo, la supervivencia, y la invasividad entre las condiciones de tratamiento. Esferoides aisladas también pueden estar incrustadas en una matriz extracelular, tal como colágeno, para evaluar y cuantificar la invasividad celular en una 3D-microambiente (Sección 2.2, Figura 4) que los modelos más exactamente en el crecimiento tumoral in vivo. Además, nuestro protocolo se puede utilizar para aislar grandes cantidades de esferoides de la matriz de MC para la proteína o preparación de ARN, lo que permite uSers para evaluar cambios en la señal celular o la expresión de genes en respuesta a las condiciones de tratamiento o de crecimiento. Nuestro protocolo de formación de esferoides requiere la optimización de suero y las concentraciones de MC, y el número de células sembradas para cada línea celular. características de las células de línea-específicas, tales como la viabilidad celular, célula-célula y la adhesividad de las células de plástico, pueden afectar significativamente a la facilidad con que se forman esferoides. En general, las líneas celulares con escasa viabilidad en cultivo en monocapa requieren mayores concentraciones séricas de promover la formación de esferoides, mientras más altas concentraciones de CM fueron los preferidos para las líneas celulares altamente adhesivas. Por lo tanto, se recomienda que las titulaciones de suero y MC realizar para determinar las condiciones óptimas para la supervivencia celular (concentración sérica), al tiempo que minimiza la formación de esferoides monocapa y por satélite (concentración MC). Estas condiciones deben resultar en la generación de un solo esferoide discreta por pocillo sin satélites. tamaño óptimo para esferoideanálisis es dependiente de la aplicación y se ve afectada por el número de células sembradas y concentración en suero (Paso 1.4.7). Siembra de las células produce un menor número de agregados más pequeños que son más fácilmente teñidas homogéneamente, pero no podrá reproducir in vivo célula-célula y las interacciones célula-microambiente. Aumentar el número de células sembradas genera esferoides más grandes, que pueden contener un núcleo hipóxico fisiológicamente representante 10 que puede afectar el comportamiento de células y alterar la interpretación de los ensayos de crecimiento o supervivencia. Sin embargo, cuando es demasiado grande, los esferoides pueden ser frágiles y se rompen con facilidad aparte o dañado durante el aislamiento. Esferoides más grandes también son mucho más difíciles de visualizar sin las plataformas de imágenes especializados para seccionamiento óptico (por ejemplo, lámina de microscopio de fluorescencia de luz) o mediante la incorporación o cryosectioning y tinción de las secciones transversales a través del esferoide 11. Se recomienda un tamaño de esferoides blanco de 200-500 micras de flexibilidad yfacilidad de manejo para la mayoría de aplicaciones. En general, es crítica para optimizar las condiciones para la formación de esferoides de una manera tanto específica línea celular y específica de la aplicación. protocolos de producción de esferoides requieren especial atención para evitar la contaminación de esferoides por el polvo y otras partículas. Las células se adhieren al polvo y otros contaminantes insolubles, dando como resultado de forma irregular, sin apretar de células adherentes agregados inadecuado para su uso en los análisis (Figura 3A). Las fuentes de contaminación pueden reducirse al mínimo mediante el paso de todas las soluciones a través de un filtro de 0,45 micras, enjuagar la monocapa de células con medio de filtrado antes de la disociación (Paso 1.4.1), y aclarado depósitos pipeta multicanal con agua ultrapura se filtró inmediatamente antes del uso (Paso 1.4.6.1). Además, pipetas serológicas filtrada de algodón, que pueden arrojar fibras en soluciones, deben ser evitados. Aunque no es crítico, el polvo puede reducirse aún más mediante el paso dissociated células a través de un filtro de células de 100 micras antes de la siembra (Paso 1.4.6). La pérdida por evaporación de medio es una consideración técnica adicional, particularmente para tiempos de incubación superiores a 1 semana, tales como los requeridos por ciertas líneas de células para la formación de esferoides (Tabla 1) o durante ensayos de anoikis (Sección 6). La evaporación puede ser minimizado mediante la siembra de células en los pozos de la región centro de las placas de múltiples pocillos, llenando perímetro pozos con agua ultrapura, y sin apretar el sellado de los bordes de la placa o revestimiento de la placa en una cámara humidificada. esferoides de células 3D son un modelo valioso para el estudio de tanto el comportamiento normal de las células y el tumor y la fisiología. El protocolo es un método rápido y económico para la generación de esferoides de células 3D constantemente de tamaño que se pueden utilizar en una variedad de ensayos y aplicaciones. Estos esferoides representan valiosas herramientas para la caracterización del crecimiento del tumor y el microambiente interacciones, así como modelos para prEvaluación eClinical de nuevas terapias.

Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo en combinaciones in vivo de célula-matriz y célula-célula interacciones que contribuyen a tejido o tumor de crecimiento 1, 2, 3. El uso de esferoides multicelulares es un enfoque reciente que reproduce con mayor precisión la arquitectura compacta de crecimiento in vivo de células 1,4. Los esferoides se pueden utilizar para investigar las interacciones célula-matriz de las células normales, pero también pueden actuar como análogos tumorales para modelar características de la progresión del tumor, como el crecimiento metastásico o resistencia a los medicamentos 4. Los esferoides pueden formarse por la proliferación de células individuales embebidos en una matriz de 5, o más rápidamente, mediante la promoción de la agregación de múltiples células para formar un clúster sola célula (por ejemplo, gota colgante, métodos de centrifugación) 6, 7. técnicas de agregación de células existentes pueden requerir materiales costosos o equipo especializado. Además, estos esferoides tienen una amplia gama de tamaños y morfologías y pueden ser difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo las comparaciones entre las condiciones de crecimiento o tratamientos difíciles. Finalmente, esferoides generados por estos métodos pueden ser difíciles de aislar de la extracel proteináceolular matriz en la que están inmersos para su uso en otras aplicaciones. A continuación, se describe un método de agregación celular robusto y fácilmente modificable para la rápida formación de esferoides de células de tamaño constantemente utilizando placas disponibles comercialmente de fondo en U de células repelente y una matriz inerte que promueve la adhesión, metil celulosa. Una vez formados, estos esferoides multicelulares son fácilmente aislados para su uso en una amplia gama de aplicaciones. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides a través de la proliferación celular, que puede utilizarse para evaluar otros procesos celulares. Aquí, se muestra ensayos de invasión celular, cuantificados mediante tinción de inmunofluorescencia, y un ensayo de anoikis, como ejemplo, las aplicaciones de estos dos protocolos diferentes de formación de esferoides.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of calcium chloride</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Used for PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer; Do not autoclave PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; wash buffer upon addition of magnesium chloride</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Spheroid Formation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>For culturing TT cell line</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter prior to use to remove particulate contaminants</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Prepare in water to 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissociation buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Invasion Assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium</td></tr><tr><td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For Immunofluorescence Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Used to stain actin at 1:200</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Used in BSA blocking buffer</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>Used for image analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>For mounting excised spheroids</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Used in MOWIOL mounting medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Used in fixation buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Used in permeabilization buffer</td></tr></tbody></table>

an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production

Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.

Se describe un método flexible y eficiente para generar esferoides discretos utilizando placas de células repelentes y medios de formación de esferoides suplementado con MC. Bajo las condiciones apropiadas de MC y el suero, las células individuales se depositan y se adhieren juntos en el centro del pozo para formar esferoides con adhesión mínima a la parte inferior también. Usando este protocolo, esferoides se generan a partir de una variedad de líneas de células (Figura 2B). Se requiere Titulación de MC y las concentraciones de suero para cada línea celular para identificar las condiciones óptimas que se forma sólo una única esferoide que es lo suficientemente robusto para permitir la manipulación sin fragmentar. De manera óptima, los esferoides fueron de entre 200 a 500 micras de diámetro, y consistieron en células estrechamente adherentes con restos de células mínima. Esferoides sobrevivieron manipulación suave y sin daños, lo que les permite ser recogida y usada en una amplia variedad de ensayos. (Figura 3A), lo que resultó en los agregados de células muertas. En la presencia de polvo u otra contaminación de la fibra, múltiple o grupos de células de forma irregular que fueron sólo débilmente agregados formados, y los esferoides resultantes fácilmente rompió aparte cuando se manipula. La formación de esferoides también se vio afectada por concentraciones subóptimas de MC o suero en el medio la formación de esferoides (figura 3B). En nuestras pruebas, muchas líneas de células eran capaces de adherirse a las placas de células repelentes en ausencia, o en bajas concentraciones, de MC, y dieron como resultado la formación de un esferoide rodeado por una monocapa de células (Figura 3B-ii). el crecimiento de células BxPC-3 en condiciones subóptimas MC se muestra como un ejemplo. En general, las concentraciones más altas de MC impidieron las células se adhieran a la bien, pero una concentración demasiado alta de MC reducen la adhesión célula-célula, y las células impedidode depositarse en el fondo del pozo, lo que resulta en la formación de agregados sueltos y numerosos esferoides satélite (Figura 3B-i). La concentración de suero también afectó a la supervivencia celular, y célula-célula, y la adhesión de células de plástico y necesitaba ser optimizado para diferentes líneas celulares. Para las líneas de células tales como HCT-116 y PANC-1, una concentración demasiado alta de suero dio como resultado la proliferación celular excesiva y la producción de esferoides de gran tamaño que se dañan fácilmente por manipulación, o promueven la adhesión celular al plástico bien y la formación de una monocapa ( Figura 3B-iii). Curiosamente, los efectos de suero insuficiente diferían entre las líneas celulares. supervivencia de las células HCT-116 se redujo y los esferoides formados eran pequeñas, que contiene una gran proporción de células muertas en el suero baja. En contraste, las células PANC-1 eran viables en ausencia de suero, pero se hicieron más adherente, y forman múltiples agregados, así como una monocapa de células (Figura 3B-iv, v). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; En los ensayos de invasión, esferoides preformadas se volvieron a suspender en el colágeno neutralizado para generar una matriz extracelular rígida (Sección 2.2, Figura 4). La posterior adición de un quimioatrayente inducida por las células individuales para mover hacia fuera desde el esferoide y invaden la matriz circundante (Figura 4B). El número de células invasoras y la distancia invadido puede cuantificarse a través de microscopía de campo claro, o por microscopía de fluorescencia en presencia de una mancha de células vivas tales como DAPI o calceína AM (secciones 3, 4). En nuestras pruebas, cambios morfológicos, tales como la formación de protuberancias, eran visibles dentro de las 6 h de tratamiento con quimioatrayente, y pudieron observarse numerosas células separar completamente del esferoide y la invasión en el colágeno dentro de 18 a 48 h. Para nuestros experimentos, se encontró que 12 a 18 h de la invasión era ideal, ya que los tiempos de incubación más largos dieron lugar a células mueve demasiado lejos de laesferoide para formación de imágenes óptima. Esferoides de colágeno embebido fija podría obtenerse imágenes por campo claro, para cuantificar la distancia y el número de células invasoras, o microscopía de inmunofluorescencia (Secciones 3-5), para la visualización de estructuras invasoras formados por las células (Figuras 5B, 5C). Una modificación del protocolo de formación de esferoides se describe, en la que las células individuales se suspendieron en una concentración más alta MC (30 mg / ml) se pueden utilizar para vigilar la resistencia a la anoikis. A estas concentraciones MC, medio todavía se puede transferir mediante una pipeta mientras fresco, pero se espesó en un gel sólido a 37 ° C. Células anoikis resistentes resuspendidas en este medio se mantuvo en suspensión y proliferaron durante un período de 2-4 semanas, la formación de esferoides en suspensión de diferentes tamaños (Figura 6B). células dependientes de anclaje no forman esferoides en estas condiciones. Hemos sido capaces de cuantificar la anoikis resistencia contando el entumecidaer de esferoides formado en cada pocillo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general de Protocolo de Formación 3D esferoide. Las células cultivadas en cultivo en monocapa se disocian, se contaron, se sedimentaron, y se resuspendieron en medio de la formación de esferoides suplementado con metilcelulosa (MC) y el suero (i-iv). La suspensión se sembró en una placa de células repelente de fondo en U en densidad deseada para permitir la formación de esferoides del tamaño deseado (v), y se incuba la placa para producir una sola, de esferoides de células discretas en cada pocillo (vi). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig2.jpg" /> Figura 2: Optimizado Condiciones formación de esferoides.(A) la formación de esferoides en condiciones óptimas para las células SH-SY5Y. 1.000 células sembradas en placas de células repelente de fondo en U en medio suplementado con 5% de suero y 1 mg / mL MC agregan en esferoides compactos dentro de 24 h. (B) Imágenes representativas de esferoides formados por varias líneas celulares en condiciones óptimas que se muestran en la Tabla 1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig3.jpg" /> Figura 3: la formación de esferoides Bajo condiciones subóptimas. Esferoides (A) formadas en la presencia de contaminantes. La contaminación microbiana resultó en la muerte celular y esferoides sin apretar agregados. En presencia de contaminantes insolubles, como el polvo o fibras, células adheridas a estos materiales y no AGGREGcomió. (B) la formación de esferoides en medio de la formación de esferoides subóptima. BxPC-3 células sembradas en presencia de exceso de MC (10 mg / ml) forman numerosos esferoides satélite (i), mientras que insuficiente MC (0 mg / ml) dieron lugar a agregados de células que se adhirieron al fondo del pozo y forman una monocapa (ii ). Se observaron resultados similares para otras líneas celulares ensayadas (no mostrados). El exceso de suero (20%) produjo un aumento de la formación de la proliferación celular y monocapa HCT-116 (iii). suero insuficiente (0%) tuvo efectos específicos de la línea de células que van de la muerte celular en HCT-116 (iv) para la formación de esferoides de satélite en PANC-1 (v). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig4.jpg" /> Figura 4: La invasión de ensayo usando esferoides. (A) Overview de ensayo de invasión esferoide. El recipiente de formación de imágenes se pre-revestido con una capa de colágeno neutralizada y se incuba para polimerizar el colágeno (i-ii). esferoides pre-formado se recogen en tubos de 1,5 mL y se resuspendieron en colágeno neutralizado (III-VI). La mezcla esferoide-colágeno se superpone sobre la base de la capa de colágeno y se incuba para polimerizar el colágeno (vii-viii). El medio de crecimiento que contiene compuestos deseados se superpone entonces sobre la capa de esferoide-colágeno polimerizado y se incuba para permitir la invasión de células (ix-x). (B) En presencia de un quimioatrayente, se muestran las células invasoras en la matriz de colágeno que rodea de un incrustado PANC-1 esferoide en los puntos de tiempo indicados. Cada panel muestra una imagen de contraste de fase adquiridos utilizando un objetivo 10X. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig5.jpg" /> Figura 5: La tinción de inmunofluorescencia de esferoides empotrados-colágeno. (A) Descripción general del protocolo para la tinción de inmunofluorescencia de esferoides. esferoides empotrados se lavan, se fijan (MNB), y se bloquearon (BSA) directamente en el recipiente de formación de imágenes. Los esferoides se pueden teñir directamente, o escindieron y se tiñeron en un volumen más pequeño, tal como un tubo de 1,5 ml. Esferoides se deben lavar con el tampón en exceso después de cada mancha para minimizar la fluorescencia de fondo. esferoides manchados se pueden obtener imágenes directamente en el recipiente o montado bajo un cubreobjetos para la imagen y el almacenamiento. Imágenes (B) de inmunofluorescencia de un esferoide de células TPC-1 integrado en el colágeno y se deja invadir por 24 h. (C) Las imágenes que muestran las células teñidas con faloidina típica de las regiones indicadas en B. Cada panel muestra la proyección Z-20 micras (0,2 micras pasos) adquirió utilizando un objetivo 60X: Las células dentro del esferoide body aproximadamente 20 micras de la superficie (1), las células que sobresalen en colágeno (2), y las células que invaden a través de colágeno (3). Barras de escala = 25 m. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig6.jpg" /> Figura 6: Ensayo de formación de esferoides Anoikis. (A) Descripción general del protocolo para el ensayo de anoikis. Las células se prepararon como se describe en la Figura 1, pero se vuelven a suspender en un medio de formación de esferoides que contiene un mínimo de 30 mg / mL MC que forma una capa de espesor para mantener las células individuales en suspensión y evitar la agregación de células (i-ii). La suspensión de células se sembraron en placas de células repelente de fondo en U y se incubaron (III-IV). Las células suspendidas se pueden monitorizar para la formación de esferoides de proliferación, lo que indica resistencia a la anoikis. ( <strong&gt; B) Imágenes representativas de la formación de colonias durante el ensayo de anoikis. se llevaron a cabo las células TPC-1 en suspensión con 30 mg / mL MC y la imagen en los puntos de tiempo indicados. Las células que son capaces de resistir anoikis proliferan para formar esferoides. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55544/55544fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Línea celular </td><td> MC (mg / mL) </td><td> Serum (%) </td><td> de incubación aproximado hora </td></tr><tr><td> SH-SY5Y </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 24 horas </td></tr><tr><td> BxPC-3 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 a 5 días </td></tr><tr><td> PANC-1 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 a 7 días </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> 3</td><td> 10 </td><td> 2 a 4 días </td></tr><tr><td> TT </td><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 7 a 10 días </td></tr><tr><td> TPC-1 </td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 1 a 2 días </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Optimal formación de esferoides de la composición del medio y de incubación Times por líneas celulares validados.

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An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vistas.  Queen's University Cancer Research Institute. Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions. 

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Bioquímica

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generación escalable de esferoides de célula uniforme mediante un dispositivo de ensamblaje acústico 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor destacado: Desarrollo de un método de ensamblaje acústico sin andamios para el cultivo de esferoides celulares 3D de alta calidad 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

Formación de esferoides multicelulares para análisis metabólicos y de hipoxia basados en FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autor destacado: Estandarización de los métodos de formación de esferoides para el análisis metabólico y de oxigenación mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

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Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

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Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

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Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

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Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares