Name: a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
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Agradecemos al Prof. Geoffrey Wasteneys, de la Universidad de Columbia Británica, por la RFP-TUB6 que expresa semillas y un revisor anónimo por las correcciones útiles. Estamos agradecidos al Prof. Hugh Dickinson por alertarnos al uso de la película de celulosa como soporte mecánico ya John Baker para la fotografía. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación BBSRC BB / G013993 / 1 y BB / D004055 / 1 a IM, y un BBSRC Doctoral Training Award y Clarendon Scholarship a CK

1. Creación de la Cámara <ol><li> Utilizando un cortador de vidrio, corte tiras de 3 mm de ancho desde el extremo de un portaobjetos de microscopio de 1 mm de espesor. Usando un cianoacrilato super-pegamento o cinta de doble cara, pegue estas tiras de vidrio aproximadamente 45 mm de separación a través de la anchura de una segunda diapositiva de microscopio ( Figura 1A ). Se requiere una diapositiva por cámara, además de diapositivas adicionales para verter placas de agar (una diapositiva producirá 2-3 placas de agar). Las diapositivas pueden reutilizarse. </li><li> Entre las tiras de vidrio, formar una junta de idéntica altura de la goma de poli (dimetilsiloxano) permeable a los gases. Colocar una bola de goma de poli (dimetilsiloxano) en la diapositiva ( Figura 1B ), mojar una segunda diapositiva con una pequeña cantidad de etanol absoluto al 100% y aplastar la bola de goma de poli (dimetilsiloxano) con la segunda diapositiva hasta que haya alcanzado la altura De las tiras de vidrio ( Figura 1C ). <ol><li> Si es necesario, recorte el exceso de poli (dimeTilsiloxano) con una cuchilla de afeitar y repetir el aplanado. </li></ol></li><li> Utilizando una cuchilla adecuada o una cuchilla de afeitar mojada en etanol absoluto, retire la parte interior de la goma de poli (dimetilsiloxano) para crear la cavidad que posteriormente sujetará la plantilla y la placa de agar ( Figura 1D ). </li><li> Cuidadosamente recortar el gel con una cuchilla de afeitar para crear una junta con un espesor de pared final de aproximadamente 2 mm ( Figura 1E ). La permeabilidad de los gases a través de una barrera de poli (dimetilsilaxano) es independiente de espesores superiores a 50 μm 11 . </li></ol> 2. Creación de la losa solidificada con agar de medio de crecimiento <ol><li> En una diapositiva microscópica con dos tiras de vidrio, coloque un cubreobjetos (22 mm x 50 mm) de modo que se apoye en ambas tiras de vidrio. </li><li> Pipetear el medio de crecimiento de Murashige y Skoog de media fuerza fundido que contiene sacarosa al 1% p / v y agar al 1,5% p / v (½ MS) en el espacio resultanteDebajo del cubreobjetos hasta que este último esté completamente lleno (aproximadamente 1 ml de volumen total) y dejar hasta que el agar se establezca (aproximadamente 5 min). Nota: Los compuestos farmacológicos pueden administrarse a través de la losa de agar mediante la adición de concentraciones apropiadas al medio líquido antes de verter la losa. Esto se probó con éxito para dexametasona 12 , isoxabeno, 2,6-diclorobenzonitrilo (DCB), orizalina y latrunculina B. </li></ol> 3 . Finalización de la configuración de la cámara <ol><li> El aire equilibra el PFD agitando un pequeño volumen de PFD en un tubo 7 . Añadir una pequeña cantidad (aproximadamente 200 μl) de PFD con equilibrio de aire al pocillo de la junta de gel, pero no llene completamente la cámara. Este PFD ayudará a evitar el atrapamiento de burbujas de aire bajo la placa de agar mientras se coloca en la cámara. </li><li> Retire el cubreobjetos de la losa de agar (en el paso 2.2 anterior) y utilice una cuchilla de afeitar para cortar una porción deTamaño y forma. Luego colóquelo en el pocillo de la junta de gel ( Figura 1F ). Debe haber un espacio de 2-4 mm a la junta alrededor. </li><li> Llene completamente la cámara con PFD con equilibrio de aire. </li><li> Coloque una o más plántulas de A. thaliana (hasta 3 plántulas para la formación de imágenes durante 2-3 días) sobre la placa de agar con los cotiledones e hipocótilo colgando sobre el borde, flotando en PFD ( Figura 1G ). </li><li> Para obtener plántulas, esterilizar las semillas con etanol al 70%, sembrar en medio ½ MS suplementado con 1% de sacarosa y 0,8% de agar, estratificar durante 2-4 días a 4 ° C y crecer en placas orientadas verticalmente a 22 ° C en un 16 H luz / 8 h régimen oscuro. Para obtener imágenes de raíces laterales, cultivar plantas durante 7-10 días antes de transferir a las cámaras de imagen. </li><li> Para cerrar la cámara, aplique un cubreobjetos que se adapte a la óptica del objetivo, presionando suavemente hacia abajo con el borde de una diapositiva de microscopio de vidrio hasta que la cubreobjetosSe apoya sobre ambas tiras de vidrio ( Figura 1H ). </li><li> Asegure el cubreobjetos con tiras de cinta quirúrgica de micropore de 1.25 cm de ancho cortadas a la mitad longitudinalmente en cada extremo si se desea ( Figura 1I ). Deje reposar la muestra durante aproximadamente 30 minutos antes de tomar imágenes. Esto minimiza el movimiento de la muestra durante la obtención de imágenes. </li><li> Realizar imágenes con un microscopio vertical para mantener un sustrato controlado para el crecimiento. Utilice los objetivos 20X / 0.7NA o 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí es una estrategia simple para la imagen confocal de alta resolución de desarrollar raíces laterales durante dos y hasta tres días. Durante períodos de hasta 48 h, no se observaron efectos adversos del sistema de imagen en el desarrollo de la raíz lateral. Después de 48 h, el crecimiento promedio de las raíces laterales comenzó a disminuir, aunque un subconjunto sustancial de las raíces (37%) siguió creciendo a tasas comparables al crecimiento promedio de las raíces en las placas. Por lo tanto, a través de imágenes un número suficientemente grande de raíces, las raíces cuyo crecimiento se ralentiza después de 48 h puede ser excluido. Las pruebas sistemáticas de las cámaras de imagen no se realizaron por períodos de más de 72 h, pero se recomiendan estrategias alternativas si se desean períodos prolongados de formación de imágenes. Las cámaras de formación de imágenes pueden dejarse en la etapa del microscopio continuamente, si se proporcionan condiciones ambientales adecuadas, o se retiran a una instalación de crecimiento y se devuelven periódicamente al microscopio. Esto permite que se formen imágenes en paralelo de numerosas cámaras. &lt;Pabellón Una ventaja de las cámaras descritas aquí es que las raíces laterales se fijan en su posición y se pueden visualizar usando lentes de inmersión de agua de alta resolución. La estabilidad espacial depende críticamente de la concentración de agar utilizada en la placa de agar de soporte. Inicialmente se ensayó una gama de concentraciones diferentes de agar 0,8% a agar 2%, lo que reveló que altas concentraciones en este rango fijaron raíces establemente en el espacio, pero el crecimiento de las raíces se ralentizó más rápido y algunas raíces mostraron signos de estrés mecánico, incluyendo el alargamiento celular reducido. Por el contrario, las concentraciones bajas de agar no proporcionaron el soporte requerido y las raíces derivaron en x, y, z durante la formación de imágenes. La losa óptima de agar de 1,5% fija la posición de la muestra sin efectos mecánicos adversos. En estas condiciones, después de asentarse en los primeros 30 min o así, las raíces son estables durante muchas horas, lo que permite la adquisición de datos durante la noche. Durante la adquisición de datos 4D, los rangos de pilas z eran típicamente bSe bloqueó por un adicional 5-10 μm, pero esto fue principalmente para acomodar el crecimiento fuera de plano de las raíces laterales en lugar de z-drift o bamboleo. Aunque la concentración estándar de agar proporciona cierta resistencia contra la penetración, las raíces gravitropicales crecientes penetrarán eventualmente en el agar. Sin embargo, a través de una modificación menor de la cámara de formación de imágenes, el crecimiento de las raíces podría mantenerse paralelo al cubreobjetos, permitiendo que las raíces laterales más antiguas y las raíces primarias sean imágenes. Además, la cámara de imagen básica podría ser fácilmente modificada para los hipocótilos. Los hipocótilos flotan más libremente en este sistema, por lo que el soporte del eje z para la adquisición de imágenes se incrementó normalmente hasta aproximadamente 20 μm. En este estudio, se utilizó un microscopio vertical, que permitió controlar las propiedades del sustrato. La cámara de formación de imágenes puede ser adaptable a configuraciones de microscopio invertido, pero la influencia dependiente del tiempo de la cubreobjetos rígida en los órganos interceptores tendrá que ser evaluada. </p&gt; Littlejohn y sus colegas han señalado que el PFD en sí mismo no disuelve fácilmente las moléculas biológicas, lo que significa que no se puede utilizar para el directamente para la entrega de compuestos farmacológicos [ 7] . Este problema se superó suministrando dichos compuestos a través de la losa de medio de crecimiento solidificado sobre el que descansa la placa de agar. Mientras que los sistemas de perfusión seguirán siendo el método de elección para experimentos de lavado, la cámara de formación de imágenes se ha utilizado con éxito para la administración de dexametasona 12 y otros compuestos. Una nota, mientras que este artículo estaba en preparación, von Wagenheim y colegas 18 describieron una cámara para el desarrollo de imágenes de la raíz lateral usando microscopía de lámina.

Para estudiar los procesos celulares y subcelulares que subyacen en el desarrollo de las plantas, existe una creciente demanda de estrategias de imagen de larga duración a largo plazo. Un desafío clave en tales experimentos de formación de imágenes es el mantenimiento de condiciones fisiológicas incluyendo suficiente intercambio gaseoso más un suministro de agua y nutrientes 1 , 2 , 3 . Para utilizar objetivos con aberturas numéricas elevadas para una óptima resolución óptica, los especímenes deben colocarse en estrecha proximidad y orientados paralelamente a la cubreobjetos. El movimiento en las direcciones x, y y z debería idealmente ser mínimo durante la obtención de imágenes. Mientras que las plántulas a menudo se montan en agua o solución acuosa para imágenes a corto plazo, el agua tiene una baja capacidad para disolver CO 2 y O 2 (1,54 mg / mL y 0,04 mg / mL, respectivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , que haceNo es adecuado para experimentos de lapso de tiempo prolongado. Los sistemas de perfusión que mantienen niveles constantes de oxígeno y nutrientes son una solución a este problema y se han desarrollado tanto para microscopía confocal de barrido láser (CLSM) 1 , 2 , 3 como para microscopía de lámina (LSM) 5 . Sistemas como el RootChip 2 y el RootArray 3 han sido diseñados específicamente para imágenes de lapso de tiempo de desarrollo de raíces e implican la germinación de semillas en un dispositivo multi-espécimen personalizado. Estas disposiciones garantizan una mínima perturbación mecánica y están diseñadas para el análisis paralelo de plántulas múltiples, pero no se optimizan para la obtención de imágenes de estructuras subcelulares. Calder y sus colegas han diseñado una cámara de imagen de perfusión más complicada optimizada para la obtención de imágenes de estructuras subcelulares en las que la muestra se mantiene en posición mediante una mallaPara permitir el uso de lentes de inmersión de alta ampliación 1 . Se presenta aquí una alternativa, simple solución a este problema que no se basa en sistemas de perfusión, pero utiliza perfluorodecalin (PFD), un perfluorocarbono que recientemente ha ganado popularidad como un medio de montaje de Arabidopsis imágenes 6 , 7 , 8 . En tales aplicaciones, la alta capacidad de PFD para disolver CO 2 y O 2 (1,9 g / mL para O 2 en PFD en comparación con 0,04 mg / mL en agua) 9 , permite el intercambio gaseoso por el tejido sumergido. Además, el PFD no es fluorescente y su índice de refracción (1.313) es comparable al del agua (1.333) y está más cerca del del citosol (~ 1.4) que del aire (1.000) 6 . Se ha reportado que los perfluorocarbonos tienen un efecto fisiológico mínimo en una variedad de plantas y plantas.Cuestiones 6 , con las semillas de rábano germinando fácilmente cuando sumergido en PFD y que muestra un crecimiento normal y el desarrollo de al menos dos días completos cuando se suministra con agua [ 10] . Observaciones similares se han hecho para la germinación de semillas de Arabidopsis [ 6] . Basado en la dispersión Raman estimulada para imagen directamente la distribución de PFD en tejidos de hoja de Arabidopsis después de la infiltración, Littlejohn y colegas concluyen que el PFD probablemente no es tomado por las células vivas [ 8] . PFD se ha utilizado previamente predominantemente a la imagen de los tejidos aéreos, donde aumenta significativamente la profundidad de la imagen ya que fácilmente infiltra espacios de aire debido a su baja tensión superficial [ 6] . Aquí, PFD se adopta para la imagen confocal a largo plazo de desarrollar las raíces laterales. En esta configuración, se colocan una o más plántulas sobre una losa de medio de crecimiento solidificado con agar y sumergida en PFD. El PFD permite gAseo en la cámara de imagen, evitando la anoxia. El PFD es altamente volátil por lo que es retenido por una junta de goma de poli (dimetilsiloxano) que también tiene alta permeabilidad al gas (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 para CO 2 ) 11 . Los nutrientes y el agua son suministrados por la losa de medio solidificado con agar. Al mismo tiempo, esta placa de agar presiona suavemente la raíz contra la cubreobjetos, fijando así su posición relativa en la cámara de formación de imágenes y permitiendo el uso de lentes de inmersión en agua de alta resolución. Además, la placa de agar puede utilizarse para administrar una gama de tratamientos farmacológicos, incluyendo dexametasona, orizalina e isoxabeno. Las cámaras de formación de imágenes se pueden ensamblar en grandes cantidades a partir de diapositivas de microscopía estándar utilizando un equipo mínimo. Las cámaras de imagen se desarrollaron y caracterizaron para estudiar el desarrollo de la raíz lateral, pero son adaptables a la imagen de otros órganos de plántulas, tales como puntas de raíz primaria yHipocótilos.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Varios aspectos del desarrollo de las plantas, como la morfogénesis de la raíz lateral, se producen en intervalos de tiempo de varios días. Para estudiar los procesos celulares y subcelulares subyacentes, se requieren estrategias de microscopía de lapso de tiempo de alta resolución que preserven las condiciones fisiológicas. Los tejidos vegetales deben tener un suministro adecuado de nutrientes y agua con intercambio gaseoso sostenido, pero cuando son sumergidos e inmovilizados bajo una cubreobjetos, son particularmente susceptibles a la anoxia. Una estrategia que se ha empleado con éxito es el uso de un sistema de perfusión para mantener un suministro constante de oxígeno y nutrientes. Sin embargo, tales arreglos pueden ser complicados, engorrosos y requieren equipo especializado. Se presenta aquí una estrategia alternativa para un sistema de imagen simple que utiliza perfluorodecalina como medio de inmersión. Este sistema es fácil de instalar, requiere un equipo mínimo, y se monta fácilmente en una etapa de microscopio, permitiendo que varias cámaras de imagen se establezcan y formen imágenes en parAlelo En este sistema, las tasas de crecimiento de las raíces laterales son indistinguibles de las tasas de crecimiento en condiciones estándar en placas de agar durante los dos primeros días, y el crecimiento de las raíces laterales continúa a tasas reducidas durante al menos otro día. Los tejidos de las plantas se suministran con nutrientes a través de una losa de agar que se puede utilizar también para administrar una gama de compuestos farmacológicos. El sistema se estableció para monitorear el desarrollo de la raíz lateral, pero es fácilmente adaptable a la imagen de otros órganos de la planta tales como hipocótilos y raíces primarias.

Las raíces laterales crecen a velocidades fisiológicas en las cámaras de imagen. Se midieron las longitudes de raíces laterales de las plantas en cámaras de formación de imágenes a intervalos de una hora ( Figura 2A , izquierda, Película 1, n = 23) y se compararon las tasas de crecimiento con las de raíces laterales cultivadas en placas de Petri estándar que contenían el mismo medio solidificado con agar . 2A , derecha, Película 2, n = 23). Las tasas de crecimiento pueden variar considerablemente entre las raíces laterales, siendo la longitud de la raíz un factor determinante debido a las zonas cada vez más largas de crecimiento y proliferación 13 . Por lo tanto, se seleccionaron conjuntos de raíces laterales para representar raíces de diferentes longitudes iniciales (que van desde 50 μm hasta 1150 μm) tanto en la cámara de formación de imágenes como en la placa de agar. Longitud media de la raíz lateral al inicio del experimentoFue similar en cada conjunto (439 y 442 μm para cámaras y placas de imagen, respectivamente). En el intervalo de tiempo analizado de 27 h, el crecimiento de raíz lateral fue aproximadamente lineal tanto en cámaras de imagen como en placas, con una tasa de crecimiento promedio de 52 μm / h (R 2 = 0,997) en placas y 51 μm / h en cámaras de imagen R $ ₂ $ = 0,993) ( Figura 2B ). Las tasas de crecimiento de las raíces laterales individuales son muy variables tanto en placas como en cámaras de imagen ( Figura 2C ), que van desde 17 μm / h hasta 82 μm / h en cámaras de imagen y de 13 μm / h a 87 μm / h en placas. Aunque las tasas de crecimiento generalmente aumentaron con la longitud de la raíz, las tasas de crecimiento todavía variaron sustancialmente entre las raíces de longitud similar, pero la varianza fue similar en las cámaras de imagen y en las placas. Las raíces laterales proliferan en cámaras de imagen y pueden serGh objetivos de apertura numérica. Las imágenes de las raíces laterales coexpresando el marcador de la membrana plasmática NPSN12-YFP 14 y el marcador de microtúbulos UBQ1 :: mRFP-TUBULINA BETA6 (RFP-TUB6) 15 fueron documentadas por CLSM 10 a intervalos de 1 h para documentar el comportamiento de los microtúbulos durante la proliferación celular en cámaras de imagen ( Figura 2D , Película 3). En estas cámaras, las raíces laterales eran muy estables en su posición en los ejes x, y y z, permitiendo la adquisición de pilas confocales continuas en lapso de tiempo durante varias horas. Las células meristemáticas proliferaron continuamente, como es evidente a partir de la formación de bandas preprofásicas ( Figura 2D , flechas verdes), haces mitóticos ( Figura 2D , flechas blancas) y fragmoplastos ( Figura 2D , flechas azules). Al igual que con las plántulas en placas de Petri,Las células de raíz completamente alargadas en las cámaras de formación de imágenes iniciaron los pelos radiculares ( Figura 2A , Figura 2D , cabezas de flecha), indicando además que el desarrollo se desarrolló como se esperaba en las cámaras de formación de imágenes. Para proporcionar un amplio campo de visión, las imágenes de la Figura 2D se obtuvieron con un objetivo NA de 20x / 0,7. También fue posible obtener imágenes de alta resolución de raíces laterales utilizando un objetivo de inmersión en agua NA de alta apertura numérica 63x / 1.2 ( Figura 2E ). El crecimiento de la raíz lateral se mantiene en las cámaras de imagen hasta por tres días. Para cuantificar cuánto tiempo las cámaras de imagen podrían soportar el crecimiento de las raíces laterales a velocidades fisiológicas, se cuantificó la longitud de la raíz lateral en cámaras de imagen (n = 27) y en placas (n = 33) a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. Las raíces de choSen eran menores de 200 μm a 0 h, con una longitud media de raíz lateral de 117 μm en cámaras de formación de imágenes y 121 μm en placas. Dado que las raíces más cortas crecen más lentamente en promedio ( Figura 2C ), que creció en el borde de la placa de agar menos a menudo, y eran más fáciles de imagen. El crecimiento promedio de todas las raíces laterales no fue significativamente diferente en las cámaras de imagen en comparación con las placas de Petri en las primeras 48 h ( Figura 3A ). Sin embargo, el crecimiento promedio se redujo significativamente entre 48 h y 72 h ( Figura 3A ). Aunque las tasas de crecimiento parecen ralentizar en general en las cámaras de imagen después de 48 h, las tasas de crecimiento entre los individuos siguen siendo muy variables ( Figura 3B , 3C ), lo que significa que hay un subconjunto sustancial de raíces laterales que crece a tasas comparables en placas y en cámaras Durante el período completo de crecimiento de 72 h. 23 de las 33 raíces laterales cultivadasEn placas (69,7%) alcanzan una longitud dentro de una desviación estándar de la longitud media a 72 h (entre 927 y 3,163 μm, Figura 3B , rojo). 10 de 27 (37,0%) raíces laterales en cámaras de imagen alcanzan una longitud dentro de este intervalo ( Figura 3B , rojo). Las cámaras de imagen se pueden adaptar fácilmente para las raíces laterales más antiguas, raíces primarias e hipocótilo . Una de las limitaciones del diseño original de la cámara de imágenes fue que mientras la placa de agar duro proporcionaba cierta resistencia mecánica, las raíces gravitropicales eventualmente penetraron en la placa de agar, resultando en pérdida de calidad de imagen ( Figura 4B ) y crecimiento más allá de la distancia de trabajo de NA alta Incluso el objetivo relativamente largo de 0,3 mm de distancia de trabajo 63X / 1,3 NA CS2. Las raíces laterales jóvenes carecen del contenido de statolitoColumela células necesarias para el gravitropismo 17 por lo que inicialmente creció paralelo a la cubreobjetos en las cámaras de imagen ( Figura 2E ]. A medida que crecen más y columela y statoliths forman, las raíces laterales muestran aumento gravitropismo positivo, mientras que las raíces primarias muestran una fuerte respuesta gravitrópica desde la germinación en adelante. Esto limita a unas pocas horas el período durante el cual las raíces primarias pueden ser visualizadas y limita severamente la longitud de inicio de las raíces laterales que se pueden visualizar de forma continua durante 48 h o más. Para superar esta limitación, la cámara se modificó de tal manera que el crecimiento se mantiene paralelo a la cubreobjetos por una membrana celulósica de celofán que actúa como una barrera de penetración en la superficie de la placa de agar ( Figura 4A ). Los intentos iniciales utilizando una losa de agar al 1,5% causaron un crecimiento reducido de las raíces en las primeras 24 h, debido quizá al estrés mecánico. Las concentraciones más bajas de agar en la losa se probaronD se encontró que en cámaras con una placa que contenía 0,8% de agar y película de celulosa, las tasas de crecimiento de las raíces laterales jóvenes no difirieron significativamente de las tasas de crecimiento en cámaras convencionales durante las primeras 48 h. Por 0-24 h, el crecimiento promedio de la raíz en las cámaras de celulosa y cámaras convencionales fue de 242 μm y 262 μm respectivamente (p = 0,78 Student t-Test) y durante 24-48 h fue 330 μm y 355 μm 1 respectivamente (p = 0,67 Student&#39;s T-Test); N = 12 y n = 11, respectivamente. Esta disposición impidió que las raíces laterales crecieran lejos de la cubreobjetos, en el agar, y también permitió la proyección de imagen de raíces primarias por hasta 48 h ( Figura 4C ). Para probar si las cámaras de imagen se podrían adaptar para órganos distintos de las raíces, se eligieron hipocótilos de Arabidopsis. Los hipocótilos son sustancialmente más gruesos que las raíces, por lo que en la cámara de formación de imágenes convencional,Los ells fueron exprimidos contra la cubreobjetos, llevando a la deformación. Por lo tanto, se desarrolló un diseño alternativo utilizando diapositivas de cavidad que contienen una depresión ovalada en su centro ( Figura 4D ). En esta configuración, se colocó una plancha de agar de 1 mm de grosor (preparada como en el punto 2.2 anterior) con un extremo sobresaliendo unos pocos mm en la cavidad de deslizamiento ( Figura 4D ). Los hipocótilos se colocaron por encima de la cavidad en la diapositiva mientras que la raíz se colocó encima de la parte horizontal. Esto aseguró que la plántula se fijó en el espacio por la raíz, pero el hipocótilo no se aplastó. Mientras que las tasas de crecimiento en las cámaras en comparación con las placas no fueron cuantificados sistemáticamente, hipocotilos en las cámaras de imagen exhibió la ola bien descrita de crecimiento longitudinal migrando hasta el hipocotilo ( Figura 4E , 4F ) [ 16] . <img alt="Figura 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ archivos / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Montaje de una cámara de imagen. Todos los detalles se describen en el texto. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figura 2 : Las raíces laterales crecen bajo condiciones fisiológicas en cámaras de imagen. ( A ) desarrollo de la raíz lateral de Arabidopsis en una cámara de imágenes (izquierda) y en una placa (derecha) durante 25 h (luz constante, incubación horizontal, imágenes simultáneas). Barras de escala = 200 μm. ( B ) Parcela que muestra longitudes de raíces laterales durante 27 h (medidas en intervalos de 1 h), de raíces laterales como se muestra en ( A ). Individual(N = 23 para placas y cámaras de imagen), longitud media en círculos rojos. Barras de error = 1 SD. La línea roja es de ajuste lineal a través de longitudes promedio. ( C ) Parcela que muestra la tasa de crecimiento promedio de todas las raíces laterales mostradas en ( B ) con respecto a su longitud inicial. ( D ) Proyecciones de intensidad máxima de pilas confocales 3D adquiridas a partir de raíces laterales que expresan NPSN12-YFP y RFP-TUB6 en puntos de tiempo consecutivos. Inserción: Ampliación de la región en caja. Flechas verdes: bandas preprofase; Flechas blancas: husos mitóticos; Flechas azules: phragmoplasts; Puntas de flecha: pelos de raíz. ( E ) Proyecciones de intensidad máxima de imágenes de alta resolución adquiridas a partir de una raíz lateral joven de la línea transgénica mostrada en ( D ) usando un objetivo 63X / 1.2 NA y un muestreo de Nyquist (dimensiones de píxel 77 nm x 77 nm) a 0 h y 16 marido; Los asteriscos localizan células idénticas en cada punto de tiempo; Flecha indica una celda que se divide entre 0h y 16 h.Barras de escala = 50 μm (AC); 20 mu m (E). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figura 3 : Desarrollo de la raíz lateral a largo plazo en cámaras de imagen. ( A ) Parcela que muestra el crecimiento promedio absoluto de la raíz en tres intervalos consecutivos de 24 h en cámaras de formación de imágenes en comparación con las placas. Ns indica p&gt; 0,05; *** indica p &lt;0,001 (prueba t de Student). N = 33 (placas) y n = 27 (cámaras de formación de imágenes). ( B ) Parcela que muestra longitudes de raíces laterales en puntos de tiempo consecutivos en todas las raíces usadas en (A). Rojo: todas las raíces laterales con una longitud final dentro de 1 SD de la media de todas las raíces laterales crecidas en placas (entre 927 y 3163 μm). ( C ) Máximo enTenacidad de las pilas confocal 3D representativas del marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP en las raíces laterales, adquiridas en puntos de tiempo consecutivos durante 72 h. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figura 4 : Las cámaras de imagen pueden ser adaptadas para otros órganos de la planta. ( A - C ) Adaptación de cámara de imagen para raíces primarias. ( A ) Esquema del diseño de cámara de imagen. Esto es idéntico al diseño estándar ( Figura 1 ) aparte de dos modificaciones: la losa de medio MS contiene 0,8% de agar en lugar de 1,5% de agar y una película de celulosa (roja) se coloca entre agar y planta para prevenir el crecimientoEn el agar. ( B ) Proyecciones de máxima intensidad XY (superior) y XZ (inferior) de las pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP en la raíz primaria de una plántula de 7 días de imagen a 0 y 48 h en una proyección de imagen convencional cámara. Tenga en cuenta que la raíz crece en el agar debido a su respuesta gravitrópica. ( C ) Proyecciones de máxima intensidad XY (superior) y XZ (inferior) de las pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP en la raíz primaria de una plántula de siete días de edad reproducida a 0 h y 48 h en la formación de imágenes Con película de celulosa. Antes de la aplicación, la película de celulosa se esterilizó en etanol al 80% y se remojó en medio ½ MS lıquido. Tenga en cuenta que se impide el crecimiento gravitrópico de la raíz en el agar. ( D - F ) Adaptación de cámara de imagen para hipocótilos. ( D ) Esquema que muestra el diseño de cámara de imagen de hipocótilo. Una junta de goma de poli (dimetilsiloxano) (gris) es manufactuRojo en una diapositiva de la cavidad entre dos tiras de cristal (amarillo). Una placa de 1,5% de agar de espesor uniforme (beige) se coloca sobre la corredera, alcanzando parcialmente la cavidad. La cámara está llena de PFD (azul). Las plántulas se colocan sobre la placa de agar de manera que el hipocótilo ocupa la región inclinada hacia abajo de la placa de agar en la cavidad mientras que la raíz está posicionada en la parte horizontal del agar. La cámara se cierra con un cubreobjetos. ( E ) Proyecciones de intensidad máxima de pilas confocales 3D representativas del marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP en un hipocótilo de una plántula de dos días de edad reproducida durante 48 horas en puntos de tiempo consecutivos. ( F ) Crecimiento longitudinal en dos intervalos de tiempo consecutivos de células individuales a lo largo del eje basal a apical (posiciones relativas a 0 h a lo largo del eje mostrado en E) del hipocótilo mostrado en ( E ). Obsérvese la ola anteriormente descrita de crecimiento migrando hasta el hipocótilo [ 16] . Barras de escala = 100 μmetro. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Película 1: <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a> <img alt="Película 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Película 2: <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a> <img alt="Película 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Película 3: <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">Por favor c</a>Lame aquí para descargar esta película.

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Se presenta aquí una técnica simple para la alta resolución confocal time-lapse imágenes de desarrollo de raíces e hipocótilo por hasta 3 días utilizando objetivos de alta apertura numérica y perfluorodecalin como medio de inmersión.

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K vistas.  University of Oxford.  Se presenta aquí una técnica simple para la alta resolución confocal time-lapse imágenes de desarrollo de raíces e hipocótilo por hasta 3 días utilizando objetivos de alta apertura numérica y perfluorodecalin como medio de inmersión. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Bioingeniería

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neurociencias

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biología

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medición Espacial y Temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en plantas de Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Microscopía de luz Hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

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