The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se realiza de acuerdo con las directrices establecidas por el Reino Interior del Reino y de la Universidad de los Servicios Veterinarios de Edimburgo. 1. La infección de ratones por sonda <ol><li> Tienda Heligmosomoides polygyrus L3 larvas en agua destilada durante un máximo de seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes de su uso, lavar larvas L3 tres veces en agua destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (con freno), pero eliminar todos los 500 l de agua (para evitar larvas L3 granulado perturbador) y resuspender el pellet cada vez. </li><li> Para el tercer lavado, añadir agua a un volumen exacto (típicamente 40 ml) y aspirado de 20 l con un corte de punta de 200 l para ampliar su abertura. Coloque dos 20 muestras mu l sobre la superficie de una placa de cultivo de 60 mm y contar las larvas L3 (generalmente móvil, y el mejor se observa bajo magnificación 50X con un microscopio de disección). Resuspender el sedimento final en agua destilada a una concentration de 2.000 L3 larvas por ml. </li><li> Para la producción del ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratones 8 semanas de edad con 400 H. larvas L3 polygyrus en 200 l de agua destilada por sonda oral (restringir ratones en la posición vertical por la piel del cuello y pasar suavemente la aguja de sonda roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago). Agitar bien antes de cada infección (larvas depositan rápidamente en agua) y aspirado de 200 l en una jeringa de 1 ml; utilizar una aguja de sonda dedicado con un extremo redondeado. Para la infección experimental de ratones más jóvenes (6-8 semanas de edad), o de otras cepas puras (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc), infectar a los ratones con 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagación y Mantenimiento de H. polygyrus <ol><li> Coloque el carbón en el centro de una gran tina de plástico y deje que el agua fría del grifo corra sobre ella durante un mínimo de 30 min (carbón activado sin lavar es tóxico para las larvas L3). Escurrir el agua de la bañera y colocar el carbón de leña en two capas de papel absorbente, dejándolo expuesto al aire ambiente hasta que esté completamente seco. </li><li> Si se necesitan huevos, raspar heces primero fuera del colon con pinzas y tijeras (si es necesario). Si se necesita un gran número de larvas L3, colocar los ratones en una rejilla de alambre y recoger bolitas fecales durante varios días. </li><li> Mezclar las heces con carbón granulado en una proporción de al menos un 1: 1, para lograr una consistencia humedad suficiente para adherirse a papel de filtro. Unte una capa delgada en el centro de un poco de papel de filtro humedecido en una placa de Petri y colocar esto en una caja húmeda (añadir un poco de toalla de papel húmeda y un plato de agua) en la oscuridad durante 12-14 días. </li><li> Eliminar larvas L3 de día 7 en adelante, y recogerlas en al menos dos ocasiones antes se descarta el papel. Las larvas forman un anillo alrededor del borde del papel de filtro; levantar el papel de filtro fuera de la placa de Petri y enjuagar las larvas que quedaron de la placa (utilizando una pipeta y 5 ml de agua estéril por placa) en un tubo de 50 ml. </li><li> Ascensoren el papel de filtro y la cosecha de las larvas restante dejado en el plato con agua destilada en un tubo de 50 ml. Centrifugar la solución efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar las larvas tres veces con agua destilada y luego se almacena a 4 ° C en un máximo de 50 ml de agua destilada hasta que se requiera. NOTA: Las larvas permanecen viables e infecciosos durante al menos 6 meses. </li></ol> 3. Recolección de Adultos H. polygyrus Worms <ol><li> Preparar el aparato de Baermann modificado de antemano como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ratones Cull Catorce días después de la infección. </li><li> Lavar el abdomen con etanol al 70%. Cortar la piel sobre el abdomen y tire hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Haga incisión media para entrar en la cavidad peritoneal. </li><li> Eliminar todo el intestino delgado y grueso (de duodeno proximal al recto distal). Coloque en un plato de Petri seco. </li><li> Enderezar el intestino a lo largo de toda su longitud; extirpar el colon heces que contienen; colocar esto en un plato aparte para los preparados de huevo posteriores. </li><li> Escindir el proximales 20 cm de intestino delgado que contiene los gusanos adultos, identificados por la pared relativamente gruesa del duodeno y con frecuencia una apariencia de color rojo debido a los gusanos intra-luminal. Colocar en una (100 mm de diámetro) placa de Petri con 5 ml de solución de Hanks, se calentó a 37 ° C (dos especímenes por plato). </li><li> Abra la porción proximal del intestino gusano lleno longitudinalmente con tijeras (tijeras ronda terminado son los mejores para esto), y raspar el interior del intestino forro con dos láminas de vidrio para eliminar los gusanos. Luego deseche la pared del tubo digestivo limpio. </li><li> Gusanos punta en pequeñas bolsas de muselina, grapa cerradas y seguras con clips alrededor del borde del embudo de vidrio (Figura 1). </li><li> Llenar el embudo con la solución de Hanks y añadir aproximadamente 4 placas de Petri de gusanos en cada embudo. </li><li> Coloque el aparato en incubadora a 37ºC durante 1-2 horas, agitando suavemente a medio camino para desalojarresiduos de la preparación intestinal que puede ocluir el filtro de muselina. Tenga cuidado para evitar vertidos de escombros fuera de la bolsa de muselina - esto hará que la contaminación de la preparación final HES. Los gusanos adultos deberían haber emigrado lentamente a través de la tela de muselina y se instaló en la parte inferior del tubo de ensayo de vidrio. Cuidadosamente separe el tubo de ensayo de la manguera de caucho de conexión sobre el fregadero (teniendo cuidado de evitar la pérdida de gusanos en este punto). </li><li> Con una pipeta de plástico, transferir los gusanos en un tubo de 50 ml y lavar seis veces con Hanks &#39;solución (permiten gusanos se asienten con la gravedad, extraiga el soporte con un stripette, agregar 40 ml de Hanks&#39; solución y repita cinco veces). NOTA: lombricultura debe mantenerse estéril desde este punto en adelante. <ol><li> Mover a una campana de flujo laminar y lavar otras seis veces en solución estéril de Hank suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, listo para el cultivo in vitro. </li></ol></li><li> Cuente elgusanos adultos recuperados por la toma de dos muestras de 20 l tomadas con un corte de punta amarilla para ampliar su apertura; esperar que aproximadamente el 50% de la cantidad de larvas inoculado. </li></ol> 4. Configuración de las Culturas de HES: Preparación mediana, Lavado gusanos adultos <ol><li> Remojar los gusanos de 3,11 en aproximadamente 10 ml de RPMI suplementado con 10% de gentamicina durante 20 min, dejando el tubo de reposo en un ángulo para asegurar gusanos están completamente cubiertos. </li><li> Realice esto en una campana de flujo laminar: lavar de nuevo seis veces con solución de Hanks (suplementado con 5 U / ml de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Preparar H. medios polygrus. </li><li> El mantenimiento de la esterilidad en una campana de flujo laminar, a 500 ml de RPMI1640, añadir 11,1 ml de 45% de glucosa (concentración final 1,2% como RPMI1640 contiene 0,2% de glucosa), 5 ml de 100x Peniclllin-estreptomicina (concentración final 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina), 5 ml de L-glutamina (concentración final 2 mM), y5 ml de Gentamicina (concentración final 1%). No agregue FCS. </li><li> Gusanos alícuotas en frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 gusanos en 15 ml H. polygyrus medios de comunicación por matraz, y el lugar en posición vertical en 37 ° C incubadora (5% CO 2) durante 3 semanas. </li></ol> 5. Preparación de HES <ol><li> Recoger HES contienen medios de cultivo a partir de cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, dejando de lado la primera colección después de 24 horas de cultivo (debido a los altos niveles de contaminación por LPS y proteínas del huésped - se puede procesar por separado o se descarta). Mantenga cada recogida selectiva y claramente etiquetado con la fecha y número de lote. Reemplace con un volumen igual de H. polygyrus medios en cada ocasión. </li><li> Centrifugar HES que contiene el medio a 400 x g durante 5 min. Luego filtrar esterilizar a través de 0,2 micras filtros baja en proteínas de unión en tubos de 50 ml. Conservar en el congelador a -20ºC claramente etiquetado con la fecha de la cosecha de gusano y la fecha de HES collection. </li><li> Después de 21 días de recolección de HES de la cultura, deseche gusanos. </li><li> Piscina 500-1.000 ml de HES sobrenadante (por lo general de madre congelada, y no como la recogida primeras 24 h) y concentrarse sobre un filtro de 3.000 MWCO en el dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno. NOTA: Tenga mucho cuidado de no dejar correr el filtro seco. <ol><li> Para configurar el dispositivo de filtro, lavar primero el lado brillante de la membrana 3 kDa abajo en un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada durante 3 x 20 min mientras se agitaba. Montar el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante con membrana de filtro lado brillante hacia arriba. Lugar en el gabinete a 4 ° C y pasar 50 ml de agua destilada a través antes de comenzar a concentrarse HES agrupados. </li><li> Añadir cada tubo de HES en el dispositivo de filtración según sea necesario (100-140 ml por día), hasta que el volumen se concentró hasta 2-5 ml. </li></ol></li><li> Con el fin de eliminar los contaminantes de los medios de cultivo que contienen HES, añadir 50 ml de pyrfibrinógeno libre de PBS para el dispositivo de filtración y a continuación concentrar hasta aproximadamente 2 ml. Repita este paso dos veces (150 ml de PBS en total). Transferencia de HES en un tubo de 15 ml, esterilizar filtro (con un filtro de 0,2 micras) en una campana de flujo laminar y medir la concentración de proteína usando un espectrofotómetro (E 280 = 10) o por el ensayo de Bradford. </li><li> Alícuota, etiqueta con el número de lote y la fecha, y la congelación a -80 ° C. </li><li> Realizar un ensayo LAL cromogénico de acuerdo con los protocolos del fabricante en cada lote de HES antes de su uso. Si los niveles de LPS son mayores que 1 U LPS por 1 g de proteína, considere no utilizar este lote para experimentos in vivo o en cultivos in vitro. </li><li> Procesar las HES recogidos a las 24 horas por separado de la misma manera; Contendrá LPS y algunas proteínas del huésped y, aunque no es adecuado para experimentos funcionales, es una fuente útil de moléculas individuales que pueden ser aislados mediante purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

El ciclo de vida de H. polygyrus procede de una manera fiable consistente. Después de la ingestión natural o sonda oral de larvas L3 en el día 0, los quistes empiezan a formarse debajo de la serosa duodenal por día 5, progresando a mudas larvarias y luego emergiendo como gusanos adultos en el lumen intestinal a partir de 10 días, los huevos se pueden ver en las heces de días 14 y granulomas son visibles en la superficie serosa duodenal de día 21. El protocolo descrito anteriormente (y que se resumen en la Figura 6) permite la producción de alto rendimiento de H. productos polygyrus excreción-secreción (HES), además de la recuperación fiable de larvas L3 viable para futuras infecciones experimentales y su duración máxima. Infección por H. polygyrus ha demostrado ser protectora en modelos de asma dependientes de OVA o Der p 1 (ácaros del polvo doméstico alergeno) 14. Además, la supresión de la inflamación de las vías respiratorias puede ser transferido con CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 o CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de no sensibilizados, H. polygyrus infectados ratones. En los modelos de autoinmunidad, H. infección polygyrus ha demostrado ser supresivo en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de la esclerosis múltiple 9, y la supresión puede ser transferida con células T CD4 + CD19 + o células B de ratones infectados 24. Heligmosomoides polygyrus productos de excreción-secreción (HES) modulan la respuesta inmune del huésped y suprimir la inflamación mediada por Th2 por una serie de mecanismos (descritas en la Figura 7), incluyendo: a) La inhibición de la respuesta de las células dendríticas a la estimulación 25, b) la inducción de CD4 Las células T reguladoras Foxp3 + + 18. y c) el bloqueo de IL-33 de producción 20. HES ha demostrado ser protectora cuando se administra unat sensibilización o desafío en el modelo OVA-alumbre de asma 19 y también cuando se administra por vía intranasal con alérgeno extracto de Alternaria 20, a través de la supresión de la primera liberación de IL-33. Evitar la contaminación LPS de HES es a menudo crucial para el éxito de los futuros experimentos inmunológicos. En el protocolo descrito aquí, los pasos críticos en el logro de este son asegurar que los desechos contenidos en las bolsas de muselina del Aparato Baermann no entre en la preparación HES final (véase 2.10) y dejar de lado la solución ES de las primeras 24 horas de cultivo (ver 5.1). En los últimos años, HES se ha caracterizado a fondo en el nivel proteómico con más de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Además, ES larvas de la cuarta etapa ha sido sometido a análisis proteómico 28. El trabajo en curso incluye la caracterización de los principales componentes de glicanos de HES, se sabe que son fuertemente inmunogénico 3, y se secreta micro-RNComo que están encapsulados en vesículas 50-100 nm o exosomas (Buck et al., Presentado para su publicación). Con el establecimiento de protocolos reproducibles para la recogida de ES de este parásito altamente inmunomodulador, y con gran cantidad de datos proteómicos que identifican los componentes moleculares de HES, el escenario está listo para la identificación y prueba terapéutica de las moléculas individuales de H. polygyrus que pueden mediar efectos fundamentales sobre el sistema inmune del huésped.

Heligmosomoides polygyrus es un helminto gastrointestinal murino natural que está estrechamente relacionado con altamente prevalentes nematodos parásitos humanos 1. En contraste con otros modelos de nematodos tales como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus establece consistentemente infección crónica en ratones como un resultado directo de múltiples mecanismos potentes inmunomoduladores que emplea para suprimir la respuesta inmune 2 host. H. polygyrus tiene un ciclo de vida directo: larvas L3 infectivas son ingeridas por la transmisión de FECO oral (o se administra por sonda oral en el laboratorio), con lo cual migran a la capa subserosa del duodeno y se enquistan antes de regresar a la luz intestinal como gusanos adultos aproximadamente ocho días después de la infección inicial. El apareamiento y producción de huevos se produce a los 10 días y es posible cosechar los gusanos adultos para la cultura y la recolección de productos de excreción-secreción de day 14 en adelante 3. H. polygyrus también interactúa con la microflora comensal, con un aumento de lactobacilos presentes en ratones susceptibles infectados 4-6, y el aumento de los niveles de H. infección polygyrus tras la exposición de ratones a los lactobacilos 6. La infección activa por H. polygyrus se ha demostrado que protege contra la inmunopatología en muchos modelos animales de autoinmunidad 7-10, colitis 11,12 y alergia 13-16. No ha habido en consecuencia un gran interés en el potencial de las moléculas excretor-secretoras de este parásito (&quot;HES&quot;) para abajo-modulan patología en vivo 17,18. De hecho, los efectos protectores se ven después del tratamiento de ratones con productos de HES 19 a través de vías que están siendo identificados 18,20. Aquí se describe un protocolo para la producción fiable de Heligmosomoides polygyrus y la recuperación de sus productos secretadosque pueden ser utilizados adicionalmente para una serie de investigaciones bioquímicas e inmunológicas funcionales.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conocido como Nematospiroides dubius, y también referido por algunos como H. bakeri) es un helminto gastrointestinal que emplea varios mecanismos inmunomoduladores para establecer la infección crónica en ratones y se parece bastante infecciones por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus se ha estudiado ampliamente en el campo de la regulación inmune helmintos derivados y se ha encontrado para suprimir potentemente modelos experimentales de alergia y autoinmunidad (ambos con infección activa y productos secretados aislados). El protocolo se describe en este documento se describen la gestión de la H. ciclo de vida polygyrus para la producción constante de larvas L3, la recuperación de los parásitos adultos, y la recolección de sus productos de excreción-secreción (HES).

La susceptibilidad a la infección con H. polygyrus es controlada en gran medida por el fondo genético de la cepa de ratón (Tabla 1); Ratones C57BL / 6 y CBA son altamente susceptibles 21,22. Para el mantenimiento del ciclo de vida del parásito, el híbrido F1 entre estas dos cepas ha sido elegido por su capacidad para soportar cargas de gusano mucho más altas sin la morbilidad (daño epitelial intestinal excesiva) en comparación con cualquiera cepa parental. Sonda oral de 400 larvas L3 se utiliza para mantener el ciclo de vida en ratones F1 (que resulta en la carga de helmintos adultos que se muestran en la Figura 2), mientras que una dosis de 200 larvas L3 se utiliza generalmente para los experimentos en cepas puras homocigotos (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc). Sin embargo, puede ser necesario reducir la función de co-factores ambientales que pueden diferir entre las instalaciones de animales, tales como las variaciones en la flora intestinal esta dosis. Los lotes de HES han demostrado efi reproduciblecacia en ensayos funcionales y en la composición de proteína; Además, cuando se analizaron los sobrenadantes de cada semana sucesiva de cultivo y hasta un total de 4 semanas, se encontró que los perfiles de proteínas a ser muy similares (Figura 3). Cuando la concentración de HES se mide mediante el ensayo de Bradford (véase 5.5), el total proteína es generalmente aproximadamente 1 mg / ml (Figura 4). Un método alternativo de la concentración de HES es con un concentrador centrífugo (por ejemplo Vivaspin membrana de corte de 3 kDa), en el que las muestras se centrifugaron a 4000 g hasta en un rotor de la centrifugadora swing-out, la eliminación de las sales tampón y componentes de bajo peso molecular. Concentración centrífuga es el más adecuado para los volúmenes de procesamiento pequeños (1-10 ml) y se limita a un factor de concentración máximo de aproximadamente 30x. Cuando la recogida de HES, la evitación de la contaminación es crítica. Para evitar la contaminación con moléculas huésped, descartamos HES-containing medios de cultivo de las primeras 24 horas después de la cosecha gusano adulto en el intestino del ratón. También cuantificar el nivel de contaminación LPS en cada lote de HES con un ensayo cromogénico LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS y niveles por debajo de esta se considera despreciable 23. En nuestras manos, la mayoría de los lotes de HES están significativamente por debajo de este límite, la concentración media de LPS en HES ser 0,23 U / mg (Figura 5). Los efectos de LPS en modelos in vivo de la patología (por ejemplo, la supresión de las respuestas asmáticas) requiere al menos 10 ng de LPS 23. De ahí que la administración in vivo de 5 mg HES de un lote con 100 pg LPS / g HES incluirá 500 LPS PG, muy por debajo de la concentración efectiva donde LPS se convierte en un problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparato Baermann Baerconfiguración Aparato mann para la recolección de adultos H. polygyrus (como se describe en la sección 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: La media de Gusano Carga 14 días después de la infección con 400 larvas L3 Mean gusano agobia 14 días después de la infección con 400 larvas L3. Los puntos de datos que se muestran son de 19 rondas de infección de ratones C57BL / 6xCBA. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfiles proteicos de HES de las semanas sucesivas de Cultura perfil de SDS-PAGE de las proteínas de HES recogidos en sucesivas semanas de cultivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Cantidad final de HES de 500 ml ES que contiene el medio de rendimiento de proteína HES de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 ml de sobrenadante de cultivo. Media ± SEM muestra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: LPS contaminación de niveles de HES de contaminación LPS en 41 lotes de HES medidos por el ensayo de Limulus ameobocyte. LPS concentración mediana = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animación esquemática de H. polygyrus Ciclo de Vida Resumen de las etapas clave del ciclo de vida de una sonda nasogástrica de larvas L3, a través de la recuperación de larvas y gusanos adultos al aislamiento de HES. Figura 7: Animación esquemática de SUH y sus Funciones efectos inmunomoduladores clave de mediadores solubles y exosomas contenidas dentro de HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo (y la tensión de fondo) </td><td> Fenotipo La infección primaria </td><td> Referencia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Puras cepas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 y ratones C57BL / 10 </td><td> Susceptible </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermedio </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Inmune </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para citocinas o receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos susceptible (a); ningún cambio en la susceptibilidad, pero el aumento de granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transgénicos (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 o ratones BALB / c) </td><td> Altamente susceptible </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6) </td><td> Altamente Resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiente Th2, disminución de gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Más susceptibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> No hay cambios en la susceptibilidad </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, Aumento de la susceptibilidad </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalmente superior fecundidad </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Fecundidad y Superior# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénicos para loci inmune innata </td><td></td></tr><tr><td> Interferón de tipo 1 receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidad más alta, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Más resistentes, más granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Más susceptibles </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Las infecciones primarias con H. polygyrus en genéticamente diferentes y de genes targetted cepas de ratón.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus.

El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.4K vistas.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus. 

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Investigación

Bioquímica

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genética

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Inmunología e Infección

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean termites are dependent on protozoa in the hindguts of workers to efficiently digest wood. Lytic peptides have been shown to kill a variety of protozoan parasites (Mutwiri et al. 2000) and also protozoa in the gut of the Formosan subterranean termite, Coptotermes formosanus (Husseneder and Collier 2009). Lytic peptides are part of the nonspecific immune system of eukaryotes, and destroy the membranes of microorganisms (Leuschner and Hansel 2004). Most lytic peptides are not likely to harm higher eukaryotes, because they do not affect the electrically neutral cholesterol-containing cell membranes of higher eukaryotes (Javadpour et al. 1996). Lytic peptide action can be targeted to specific cell types by the addition of a ligand. For example, Hansel et al. (2007) reported that lytic peptides conjugated with cancer cell membrane receptor ligands could be used to destroy breast cancer cells, while lytic peptides alone or conjugated with non-specific peptides were not effective. Lytic peptides also have been conjugated to human hormones that bind to receptors on tumor cells for targeted destruction of prostate and testicular cancer cells (Leuschner and Hansel 2004).
In this article we present techniques used to demonstrate the protozoacidal activity of a lytic peptide (Hecate) coupled to a heptapeptide ligand that binds to the surface membrane of protozoa from the gut of the Formosan subterranean termite. These techniques include extirpation of the gut from termite workers, anaerobic culture of gut protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), microscopic confirmation that the ligand marked with a fluorescent dye binds to the termite gut protozoa and other free-living protozoa but not to bacteria or gut tissue. We also demonstrate that the same ligand coupled to a lytic peptide efficiently kills termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into hindgut of workers), but is less bacteriacidal than the lytic peptide alone. The loss of protozoa leads to the death of the termites in less than two weeks.
In the future, we will genetically engineer microorganisms that can survive in the termite hindgut and spread through a termite colony as "Trojan Horses" to express ligand-lytic peptides that would kill the protozoa in the termite gut and subsequently kill the termites in the colony. Ligand-lytic peptides also could be useful for drug development against protozoan parasites.

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

We present procedures for demonstrating that ligands bind to the surface membrane of the cellulose-digesting protozoa in the gut of Formosan subterranean termites using fluorescent microscopy and that ligands coupled with lytic peptides kill these protozoa in vitro (anaerobic protozoa culture) and in vivo (injection into the termite hindgut).

Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Biología

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Establecimiento De Cultivos Binarios Estables De Saccharibacterias Simbióticas De La Cavidad Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

El cultivo de

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