The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von Großbritannien Home Office und der Universität von Edinburgh Veterinary Services eingestellt geführt. 1. Infektion der Mäuse durch Gavage <ol><li> Shop Heligmosomoides polygyrus L3-Larven in destilliertem Wasser für bis zu sechs Monate bei 4 ° C. </li><li> Vor Gebrauch waschen L3-Larven dreimal in destilliertem Wasser: Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten (mit Bremse), entfernen Sie alle, aber 500 ul Wasser (um störende pelletiert L3-Larven zu vermeiden) und das Pellet jedes Mal. </li><li> Bei dem dritten Waschen, Wasser hinzufügen, um eine genaue Volumen (in der Regel 40 ml) und saugen Sie 20 ul mit 200 ul Spitze geschnitten, um ihre Öffnung zu erweitern. Platzieren zwei 20-ul-Proben auf der Oberfläche einer 60 mm Kulturschale und zählen die L3-Larven (üblicherweise mobil und am besten unter 50-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop betrachtet). Resuspendieren endgültige Pellet in destilliertem Wasser auf ein concentration von 2.000 L3 Larven pro ml. </li><li> Für Lebenszyklus Produktion, infizieren 8 Wochen alte F1 (C57BL / 6xCBA) Mäuse mit 400 H. polygyrus L3-Larven in 200 ul destilliertem Wasser durch orale Gabe (zurückhalten Mäuse in aufrechter Position durch das Genick des Halses und sanft passieren die stumpfe Sondennadel durch den Mund und Speiseröhre in den Magen). Gut geschüttelt, vor jeder Infektion (Larven begleichen schnell in Wasser) und saugen Sie 200 ul in einer 1 ml Spritze; einen dedizierten Sondennadel mit einem abgerundeten Ende. Für experimentelle Infektion von jüngeren Mäuse (6-8 Wochen alt) oder anderen Inzuchtstämme (z C57BL / 6 oder BALBc) infizieren Mäuse mit 200 L3 Larven. </li></ol> 2. Vermehrung und Pflege von H. polygyrus <ol><li> Zeigen Kohle in der Mitte eines großen Kunststoffwanne und lassen kaltes Leitungswasser, um über sie für mindestens 30 Minuten laufen (ungewaschen Aktivkohle ist giftig für L3-Larven). Lassen Sie das Wasser aus der Wanne und legen Sie die Holzkohle auf two saugfähiges Papier legen, so dass es bis zur vollständigen Trocknung der Raumluft ausgesetzt. </li><li> Wenn Eier erforderlich sind, kratzen Kot zuerst aus dem Dickdarm mit einer Pinzette (und Schere falls erforderlich). Wenn eine große Anzahl von L3-Larven erforderlich ist, platzieren Mäuse auf einem Drahtgitter und sammeln Kotpillen über mehrere Tage. </li><li> Mischen Sie die Fäkalien mit granulierte Aktivkohle bei einem Verhältnis von mindestens 1: 1, um eine Konsistenz zu erreichen nur feucht genug, um sich an Filterpapier. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf der Mitte von etwas angefeuchteten Filterpapier in einer Petrischale und legen Sie diese in einer feuchten Box (fügen Sie einige feuchten Papiertuch und eine Schüssel mit Wasser) im Dunkeln für 12-14 Tage. </li><li> Entfernen L3-Larven von Tag 7 ab, und sammeln sie auf mindestens zwei Gelegenheiten, bevor das Papier wird verworfen. Die Larven bilden einen Ring rund um den Rand des Filterpapiers; Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die Larven, die der Platte gelassen werden (mit einer Pipette und 5 ml sterilem Wasser pro Platte) in einen 50-ml-Tube. </li><li> AufzugAus dem Filterpapier und ernten die restlichen Larven links auf der Platte mit destilliertem Wasser in einen 50-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die abfließende Lösung bei 300 g für 10 min. Dreimal Waschen Sie die Larven mit destilliertem Wasser und dann bei 4 ° C lagern in bis zu 50 ml destilliertem Wasser, bis sie benötigt. HINWEIS: Die Larven bleiben lebensfähig und infektiös für mindestens 6 Monate. </li></ol> 3. Sammlung von Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereiten Sie die modifizierten Baermann Apparat im Voraus, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Cull Mäusen 14 Tage nach der Infektion. </li><li> Den Unterleib mit 70% Ethanol waschen. Schneiden Sie die Haut über den Bauch und ziehen Sie, um die vordere Bauchwand zu offenbaren. Stellen Sie Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Nehmen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm (Duodenum von proximal nach distal Rektum). Zeigen in eine trockene Petrischale. </li><li> Richten Sie den Darm über ihre gesamte Länge; Verbrauchsteuern die Fäkalien haltige Dick; legen Sie diese in eine separate Schüssel für Eierzubereitungen später. </li><li> Zuschneiden die proximalen 20 cm des Dünndarms, die die adulten Würmer von der relativ dicken Wand des Duodenums und oft eine rote Erscheinungsbild -identified aufgrund der intraluminalen Würmer enthält. In eine (Durchmesser 100 mm) Petrischale mit 5 ml Hanks-Lösung, erwärmt auf 37 ° C (zwei Exemplare pro Schale). </li><li> Öffnen Sie den Wurm-gefüllte proximalen Darmteil in Längsrichtung mit einer Schere (rund digen Schere sind am besten für diese), und kratzen im Inneren der Darmschleimhaut mit zwei Glasobjektträger um die Würmer zu entfernen. Dann werfen Sie die saubere Darmwand. </li><li> Tipp Würmer in kleine Musselin Taschen, Klammer geschlossen und mit Büroklammern um den Rand des Glastrichters (Abbildung 1). </li><li> Füllen Trichter mit Hanks-Lösung, geben Sie ca. 4 Petrischalen von Würmern in jeden Trichter. </li><li> Platz Gerät in 37 ° C-Inkubator für 1-2 h, Rühren sanft auf halbem Weg durch, um zu verdrängenSchmutz aus dem Darm Vorbereitung, die den Musselin Filter verstopfen können. Achten Sie darauf, um das Auslaufen von Schutt außerhalb des Musselinbeutel zu vermeiden - das wird eine Verunreinigung des letzten HES Vorbereitung verursachen. Erwachsene Würmer sollten langsam durch das Baumwolltuch migriert und an der Unterseite des Glasteströhrchen angesiedelt haben. Entfernen Sie vorsichtig das Reagenzglas aus dem Verbindungsgummischlauch über dem Waschbecken (dabei darauf achten, nicht zu verlieren Würmer an dieser Stelle). </li><li> Mit einem Kunststoff Pipette die Würmer in einen 50-ml-Tube und waschen sechsmal mit Hanks-Lösung (erlauben Würmer mit der Schwerkraft mit einer Stripette niederzulassen, zu entfernen Medien, 40 ml Hanks-Lösung, und wiederholen Sie fünf Mal). HINWEIS: Wurm Kultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. <ol><li> Gehen Sie zu einer Steril und waschen weitere sechs Mal in steriler Hanks-Lösung mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, bereit für die in-vitro-Kultur ergänzt. </li></ol></li><li> Zählen Sie dieerwachsenen Würmer, indem man zwei Proben von 20 ul mit einer gelben Spitze cut ergriffen, um ihre Öffnung zu erweitern erholt; erwarten, etwa 50% der Menge des inokulierten Larven. </li></ol> 4. Einrichten Kulturen für HES: Medium Vorbereitung, Waschen Erwachsene Worms <ol><li> Weichen die Würmer von 3,11 in etwa 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% Gentamycin für 20 Minuten, so dass die Röhre ruht in einem Winkel, um sicherzustellen, Würmern vollständig abgedeckt werden. </li><li> Führen Sie diese in einer Steril: nachwaschen sechsmal mit Hanks-Lösung (ergänzt mit 5 U / ml Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin). </li><li> Bereiten H. polygrus Medien. </li><li> Die Aufrechterhaltung der Sterilität in einem Abzug mit laminarer Strömung, um 500 ml des RPMI1640 Fügen 11,1 ml 45% Glukose (Endkonzentration 1,2% RPMI1640 enthält 0,2% Glucose), 5 ml 100x Peniclllin-Streptomycin (Endkonzentration 5 U / ml Penicillin, 5 &amp; ​​mgr; g / ml Streptomycin) versetzt, 5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), und5 ml Gentamycin (Endkonzentration 1%). Sie FCS hinzufügen nicht. </li><li> Aliquoten Würmer in entlüftet T25-Kolben, ca. 1.000 Würmer in 15 ml H. polygyrus Medien pro Kolben und Ort aufrecht in 37 ° C-Inkubator (5% CO 2) für 3 Wochen. </li></ol> 5. Herstellung von HES <ol><li> Sammeln HES haltigen Kulturmedien aus Kulturen in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche, die Aufhebung der ersten Kollektion nach 24 Stunden der Kultur (durch den hohen Grad der LPS Verschmutzung und Wirtsproteinen - getrennt verarbeitet oder verworfen werden). Halten Sie jede Sammlung getrennt und deutlich mit dem Datum und Chargennummer versehen. Ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von H. polygyrus Medium auf jeder Gelegenheit. </li><li> Zentrifuge HES haltigen Medien bei 400 x g für 5 min. Dann filtern sterilisieren durch 0,2 um niedrige Proteinbindung Filter in 50 ml Tuben. Shop in der -20 ° C Gefrierschrank deutlich mit Datum der Wurm Ernte und das Datum der HES c gekennzeichnetollektion. </li><li> Nach 21 Tagen der HES Sammlung von Kultur, verwerfen Würmer. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES Überstand (in der Regel aus der Tiefkühl, und nicht die, die die erste 24-Stunden-Sammlung) und einen 3.000 MWCO-Filter in der Ultrafiltrationsvorrichtung zu konzentrieren auf unter Stickstoffdruck. HINWEIS: Achten Sie sorgfältig darauf, den Filter trocken laufen lassen. <ol><li> So richten Sie das Filtergerät, zuerst die 3 kDa Membran glänzende Seite in einem 1-Liter-Becher sich gründlich mit destilliertem Wasser für 3 x 20 Minuten unter Rühren. Montieren Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung nach Angaben des Herstellers mit Filtermembran glänzenden Seite nach oben. Platz im Schrank bei 4 ° C erwärmt und 50 ml destilliertem Wasser durch, bevor Sie sich auf die Sammel HES konzentrieren. </li><li> Fügen jedes Rohr von HES in die Filtrationsvorrichtung nach Bedarf (100-140 ml pro Tag), bis das Volumen 2-5 ml eingeengt wird. </li></ol></li><li> Um Verunreinigungen von der HES-enthaltende Kulturmedien zu entfernen, 50 ml pyr hinzufügenogen freien PBS zu der Filtervorrichtung und dann konzentrieren sich auf ca. 2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (150 ml PBS insgesamt). Übertragen HES in einen 15-ml-Röhrchen, filtersterilisieren (mit einem 0,2-um-Filter) in einer Haube mit laminarer Strömung und Messen der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers (E 280 = 10) oder mit dem Bradford-Assay. </li><li> Aliquot, Label mit Chargennummer und das Datum und die Gefriert bei -80 ° C. </li><li> Führen eines chromogenen LAL Assay nach den Protokollen des Herstellers für jeden Ansatz durch HES vor der Verwendung. Wenn LPS Niveau von größer als 1 U LPS pro 1 ug Protein sind, sollten Sie nicht mit dieser Charge für in vivo-Experimenten oder in vitro-Kulturen. </li><li> Verarbeiten Sie die bei 24 Stunden getrennt in der gleichen Art und Weise gesammelt HES; es wird LPS und einige Wirtsproteine ​​enthalten und, obwohl sie nicht für verschiedene Experimente ist es eine nützliche Quelle von einzelnen Molekülen, die durch den monoklonalen Antikörper der Affinitätsreinigung isoliert werden kann. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Der Lebenszyklus von H. polygyrus Erlöse in einer konsistenten Art und Weise zuverlässig. Nach Natur Verschlucken oder orale Gabe von L3-Larven am Tag 0, beginnen Zysten unter der Zwölffingerdarm-Serosa von Tag 5 zu bilden, voran zu Larven Häutungen und Schwellenländern als erwachsenen Würmer in das Darmlumen von Tag 10, können Eier im Kot aus gesehen werden Tag 14 und Granulome auf der duodenalen Serosaoberfläche von Tag 21. Die oben beschriebenen (und in Figur 6 zusammengefaßt) -Protokoll sichtbar ermöglicht Produktion mit hohem Durchsatz von H. polygyrus Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES), zusätzlich zum zuverlässigen Wiederherstellung lebensfähiger L3-Larven für zukünftige experimentelle und Lebenszyklus-Infektionen. H. polygyrus Infektion hat sich gezeigt Schutz in Modellen von Asthma abhängig von OVA oder Der p 1 (Hausstaubmilben-Allergen) 14 sein. Darüber hinaus könnte die Unterdrückung der Atemwegsentzündung mit CD4 + CD25 + übertragen werden </sup&gt; regulatorischen T-Zellen 14 oder CD19 + CD23 hallo regulatorischen B-Zellen 24 aus nicht-sensibilisierten, H. polygyrus infizierten Mäusen. Bei den Modellen der Autoimmunität, H. polygyrus Infektion wurde gezeigt suppressive in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell von Multipler Sklerose 9 zu sein, und die Unterdrückung kann entweder mit CD4 + T-Zellen oder CD19 + B-Zellen aus infizierten Mäusen 24 übertragen werden. Heligmosomoides polygyrus Ausführungs sekretorischen Produkten (HES) modulieren die Immunantwort des Wirts und Th2-vermittelte Entzündung unterdrücken, indem eine Reihe von Mechanismen (in Abbildung 7 beschrieben), einschließlich: a) Hemmung der dendritischen Zellen gegenüber Stimulation 25, b) Induktion von CD4 + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen 18. und c) die Blockierung von IL-33 Produktion 20. HES hat sich gezeigt, schützend zu sein, wenn sie verabreicht eint Sensibilisierung oder Herausforderung in der OVA-Alaun-Modell von Asthma 19 und auch, wenn intranasal mit Alternaria Extrakt Allergen 20 verabreicht, durch Unterdrückung der frühen IL-33 Freisetzung. Vermeidung der LPS Kontamination von HES ist oft von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Zukunft immunologischen Experimenten. Im Protokoll hier skizzierten die kritischen Schritte bei der Erreichung dieses sind, dass innerhalb der Musselin Taschen der Baermann Gerät nicht in die endgültige HES Zubereitung enthaltenen Schmutz zu gewährleisten (siehe 2.10) und zur Seite zu ES-Lösung aus der ersten 24 Stunden der Kultur gesetzt (siehe 5.1). In den letzten Jahren HES wurde gründlich an der Proteom-Ebene mit mehr als 370 identifiziert 26,27 unterschiedliche Proteine ​​aus. Darüber hinaus hat ES aus dem 4. Larvenstadium zu Proteomanalyse 28 unterzogen. Laufende Arbeiten Charakterisierung der Hauptkomponenten von Glycan HES bekannte stark immunogen 3 zu sein, und sezernierten Mikro RNWie die in 50 bis 100 nm Bläschen oder Exosomen (Buck et al., Zur Publikation eingereicht) gekapselt. Mit der Gründung der reproduzierbaren Protokolle für die Sammlung von ES aus diesem hoch immunmodulatorische Parasiten und mit umfangreichen proteomische Daten zur Identifizierung der molekularen Komponenten von HES ist die Bühne nun für die Identifizierung und therapeutische Prüfung einzelner Moleküle aus H. eingestellt polygyrus die Schlüssel Auswirkungen auf das Immunsystem des Wirts zu vermitteln können.

Heligmosomoides polygyrus ist ein natürlicher Maus-Magen-Darm-Helminthen, die eng mit hoch vorherrschende menschliche Nematodparasiten 1 verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen Nematoden Modelle wie Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsequent stellt eine chronische Infektion in Mäusen als eine direkte Folge von mehreren leistungsstarken immunmodulatorische Mechanismen beschäftigt, um die Immunantwort des Wirts 2 zu unterdrücken. H. polygyrus hat einen direkten Lebenszyklus: infektiösen L3-Larven werden von feco-orale Übertragung aufgenommen (oder durch orale Gabe in der Laborumgebung verabreicht), worauf sie wandern zum subseröse Schicht des Zwölffingerdarms und encyst vor der Rückkehr in das Darmlumen als erwachsenen Würmer etwa acht Tage nach der ersten Infektion. Paarung und Eierproduktion tritt am Tag 10 und es ist möglich, adulte Würmer für Kultur und Sammlung von Ausscheidungs-sekretorischen Produkte da ernteny 14 ab 3. H. polygyrus interagiert auch mit der kommensalen Mikroflora, mit erhöhter Milchsäurebakterien vorhanden in infizierten Mäusen anfällig 4-6, und ein höheres Maß an H. polygyrus Infektion nach Exposition von Mäusen auf Laktobazillen 6. Aktive Infektion mit H. polygyrus wurde gezeigt, dass gegen Immunpathologie in vielen Tiermodellen für Autoimmunität 7-10 schützen, Colitis 11,12 und Allergien 13-16. Daher gab es großes Interesse an dem Potenzial der Ausscheidungs-Sekretorische Moleküle aus diesem Parasiten (&quot;HES&quot;), um nach unten zu modulieren Pathologie in vivo 17,18. Tatsächlich werden schützende Wirkung nach der Behandlung der Mäuse mit HES-Produkte 19 über Pfade, die jetzt identifiziert 18,20 ersichtlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die zuverlässige Herstellung von Heligmosomoides polygyrus und Wiederherstellung ihrer abgesondert Produktedaß weiter eine Reihe von funktionellen biochemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (früher Nematospiroides dubius bekannt und auch von einigen als H. bakeri bezeichnet) ist ein gastrointestinaler Helminthen, die mehrere immunmodulatorische Mechanismen einsetzt, um eine chronische Infektion in Mäusen herzustellen und ähnelt vorherrschenden menschlichen Wurminfektionen. H. polygyrus wurde ausgiebig auf dem Gebiet der Wurm abgeleitete Immunregulation studiert und hat sich als potent drücken experimentellen Modellen von Allergie und Autoimmunität (beide mit einer aktiven Infektion und isoliert abgesondert Produkte). Die in diesem Papier beschriebene Protokoll beschreibt Verwaltung des H. polygyrus Lebenszyklus für eine konsistente Produktion von L3-Larven, die Verwertung von erwachsenen Parasiten und Sammlung ihrer Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES).

Die Anfälligkeit für eine Infektion mit H. polygyrus wird zu einem großen Teil durch den genetischen Hintergrund der Mausstamm (Tabelle 1) gesteuert wird; C57BL / 6 und CBA-Mäusen sind sehr anfällig 21,22. Für die Versorgung der Lebenszyklus des Parasiten hat die F1-Hybride zwischen diesen beiden Stämmen für seine Fähigkeit, sehr viel höher Wurmlast ohne Morbidität (übermäßige Darmepithelzellen Schäden) zu widerstehen, verglichen mit entweder Elternstamm ausgewählt. Oralsonde 400 L3 Larven wird der Lebenszyklus in F1-Mäuse zu erhalten (was zu Erwachsenen in 2 gezeigt Wurmlast), während eine Dosis von 200 L3 Larven wird allgemein für Experimente bei homozygoten Inzuchtstämmen (beispielsweise C57BL / 6 verwendet oder BALBc). Allerdings müssen diese Dosierung kann je nach Umgebungs Cofaktoren, die zwischen Tierhaltung, wie Schwankungen der Darmflora unterscheiden können reduziert werden. Chargen von HES haben reproduzierbare effi bewährtsamkeit in funktionellen Assays und Protein-Zusammensetzung; Außerdem, wenn Überstände von jedem aufeinanderfolgenden Woche Kultur wurden analysiert, bis zu insgesamt 4 Wochen wurden die Proteinprofile gefunden, sehr ähnlich (Figur 3). Wenn HES Konzentration wird mittels Bradford-Test gemessen (siehe 5.5) werden die Gesamt Protein ist in der Regel etwa 1 mg / ml (Figur 4). Ein alternatives Verfahren zum Konzentrieren von HES mit einem Zentrifugenkonzentrator (zB Vivaspin 3 kDa cut-off Membran), in denen die Proben werden auf bis zu 4.000 g in einem Ausschwingrotor Zentrifuge, Entfernen Puffersalze und niedrigmolekulare Bestandteile. Kreisel Konzentration ist am besten für kleine Verarbeitungsmengen (1-10 ml) geeignet und sind auf eine maximale Konzentration etwa den Faktor 30x begrenzt. Beim Sammeln von HES, ist die Vermeidung der Kontamination von entscheidender Bedeutung. Um eine Kontamination mit Gastmolekülen zu vermeiden, entsorgen wir HES-containing Kulturmedien von der ersten 24 Stunden nach der erwachsene Wurm Ernte aus dem Mausdarm. Wir die Höhe der LPS Verschmutzung quantifizieren auch in jeder Charge von HES mit einem chromogenen LAL-Test (siehe 5.7). 1 U LPS entspricht ~ 100 pg LPS und Ebenen darunter werden als vernachlässigbar angesehen 23. In unseren Händen, die meisten Partien von HES deutlich unter dieser Grenze, die mittlere Konzentration von LPS in HES als 0,23 U / ug (Abbildung 5). Die Wirkungen von LPS in in vivo-Modellen der Pathologie (zum Beispiel die Unterdrückung von asthmatischen Reaktionen) benötigt mindestens 10 ng LPS 23. Daher in vivo-Verabreichung von 5 ug HES aus einer Charge mit 100 pg LPS / ug HES umfasst 500 pg LPS deutlich unter die effektive Konzentration in dem LPS zu einem Problem. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Baermann Apparat BaerMann Versuchsaufbau für die Sammlung von Erwachsenen H. polygyrus (wie in Kapitel 2 beschrieben). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Mittlere Worm Burden 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3 Larven Mittlere Wurm belastet 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3-Larven. Gezeigten Datenpunkte sind aus 19 separaten Runden der Infektion von C57BL / 6xCBA Mäusen. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Proteinprofile von HES aus aufeinanderfolgenden Wochen in Kultur SDS-PAGE-Profil von HES-Proteine ​​in aufeinander folgenden Wochen der Kultur gesammelt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: </strong&gt; Endmenge von HES 500 ml ES-haltigen Medien Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen von ca. 500 ml Kulturüberstand stammt. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: LPS Kontamination von HES Ebenen LPS Kontamination in 41 Chargen von HES durch die Limulus ameobocyte Assay gemessen. Median LPS-Konzentration = 86 U pro mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Animated H. polygyrus Lebenszyklus Zusammenfassung der wichtigsten Phasen des Lebenszyklus von orale Gabe von L3-Larven, durch Rückgewinnung von Larven und erwachsenen Würmer zu Isolierung von HES. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Animated HES und ihre Funktionen Taste immunmodulatorische Effekte von in HES enthaltenen löslichen Mediatoren und Exosomen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (und Hintergrund Stamm) </td><td> Primäre Infektion Phänotyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inzuchtstämmen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 und C57BL / 10 </td><td> Anfällig </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Zwischen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Geringe Empfindlichkeit </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für Cytokine oder Cytokinrezeptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Weniger anfällig (a); keine Änderung in der Empfindlichkeit, sondern erhöht Granulome (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2R &amp; beta; Transgenic (C57BL / 6) </td><td> Beständig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R-- / - (C57BL / 6 und BALB / c) </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c oder C57BL / 6) </td><td> Highly Resistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Beständig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, verringert Granulom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Keine Veränderung der Empfindlichkeit </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hohe Th1, Erhöhte Anfälligkeit </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für die T-Zell-Marker </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Geringfügig höheren Fruchtbarkeit </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für angeborene Immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Typ-1-Interferon-Rezeptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Widerstandsfähiger, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Anfälliger </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primäre Infektion mit H. polygyrus in genetisch unterschiedliche und gezielte Gen-Mausstämme.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus.

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.3K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus. 

Serie: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Forschung

Biochemie

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

Transiente Transduktion der strobatierten Formen von Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetik

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Immunologie und Infektion

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean termites are dependent on protozoa in the hindguts of workers to efficiently digest wood. Lytic peptides have been shown to kill a variety of protozoan parasites (Mutwiri et al. 2000) and also protozoa in the gut of the Formosan subterranean termite, Coptotermes formosanus (Husseneder and Collier 2009). Lytic peptides are part of the nonspecific immune system of eukaryotes, and destroy the membranes of microorganisms (Leuschner and Hansel 2004). Most lytic peptides are not likely to harm higher eukaryotes, because they do not affect the electrically neutral cholesterol-containing cell membranes of higher eukaryotes (Javadpour et al. 1996). Lytic peptide action can be targeted to specific cell types by the addition of a ligand. For example, Hansel et al. (2007) reported that lytic peptides conjugated with cancer cell membrane receptor ligands could be used to destroy breast cancer cells, while lytic peptides alone or conjugated with non-specific peptides were not effective. Lytic peptides also have been conjugated to human hormones that bind to receptors on tumor cells for targeted destruction of prostate and testicular cancer cells (Leuschner and Hansel 2004).
In this article we present techniques used to demonstrate the protozoacidal activity of a lytic peptide (Hecate) coupled to a heptapeptide ligand that binds to the surface membrane of protozoa from the gut of the Formosan subterranean termite. These techniques include extirpation of the gut from termite workers, anaerobic culture of gut protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), microscopic confirmation that the ligand marked with a fluorescent dye binds to the termite gut protozoa and other free-living protozoa but not to bacteria or gut tissue. We also demonstrate that the same ligand coupled to a lytic peptide efficiently kills termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into hindgut of workers), but is less bacteriacidal than the lytic peptide alone. The loss of protozoa leads to the death of the termites in less than two weeks.
In the future, we will genetically engineer microorganisms that can survive in the termite hindgut and spread through a termite colony as "Trojan Horses" to express ligand-lytic peptides that would kill the protozoa in the termite gut and subsequently kill the termites in the colony. Ligand-lytic peptides also could be useful for drug development against protozoan parasites.

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

We present procedures for demonstrating that ligands bind to the surface membrane of the cellulose-digesting protozoa in the gut of Formosan subterranean termites using fluorescent microscopy and that ligands coupled with lytic peptides kill these protozoa in vitro (anaerobic protozoa culture) and in vivo (injection into the termite hindgut).

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Biologie

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Etablierung stabiler binärer Kulturen symbiotischer Saccharibakterien aus der Mundhöhle

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Der Anbau von

Zusammenfassung

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