Name: in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow
Uploaded: 2015-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
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The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: La Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los experimentos. 1. Elaboración de Instrumentos Ultrasonido-microinyección y embriones <ol><li> Establecer el escenario, montaje, y la sonda (Figura 1), así como los instrumentos quirúrgicos (Figura 2). Solución salina tamponada (PBS) Place solución de fosfato (pH 7,4) en un baño a 37 ° C el calentamiento. Llenar aguja de microinyección completamente con aceite mineral, usando 1 ml jeringa conectada a un segundo G aguja flexible 25, a través de su base. </li><li> Fijar la aguja en la rotación de montaje del brazo, y la aguja vacía de solución de aceite mineral. Vuelva a llenar con 2,5 l de solución TL. Asegúrese de que no hay burbujas de aire dentro de la aguja de inyección. Gire el brazo de la aguja hacia la pared, fuera de los escenarios. </li><li> Anestesiar la madre embarazada en la cámara de anestesia mediante infusión continua de isoflurano. Cuando la madre está inconsciente, la transferencia de la anestesia para tubo nariz colocada en el caudal lado del escenario, y el lugar madre en posición supina, con el hocico en el tubo de la nariz para permitir la continuación de un estado totalmente anestesiado. </li><li> Extremidades de cinta en ángulos de 45 °, o con las manos y los pies descansados ​​y posicionados overtop ECG pestañas / monitor de temperatura. Es importante que la presa embarazada se monitoriza continuamente para asegurar que la anestesia es suficiente y que la pomada en aplicada a los ojos para reducir el secado. </li><li> Aplique el producto a través de la eliminación del vello inferior del abdomen de la madre, limpie suavemente con hisopos de algodón seco, y luego de nuevo con un 70% hisopos de algodón con etanol saturado para eliminar cualquier exceso de producto y el cabello. Asegúrese de limpiar la piel abdominal fuera de todo el pelo en el sitio de la incisión (Figura 3). </li><li> Realice una laparotomía en la madre embarazada utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas finas. Tenga cuidado de no cortar ninguna vasos principales u órganos viscerales. Hacer primero, incisión recta de epidermis 1,5-2 cm por encima de la vagina y continuar cortar hacia las costillas para approximately 2-3 cm. Exponer la membrana subcutánea, busque la línea alba (&quot;línea blanca&quot;) (Figura 3), y corte paralela a la incisión inicial, a lo largo de la misma longitud, para exponer interno órganos viscerales y sáculos uterinos. </li></ol> 2. Extracción de embriones <ol><li> Utilice bastoncillos de algodón de 6 pulgadas de maniobrar madre y embriones. Presione suavemente (no la fuerza) en la piel con aplicador para manipular primer embrión de la apertura de la incisión. Después de la extracción del primer sáculo embrión, suave y lentamente tire del resto del cuerno uterino a través y hacia el exterior de la madre. Evite tirar intestino u otros órganos a través de la incisión en esta etapa. </li><li> Cuantificar los embriones y coloque suavemente cuerno uterino izquierdo de nuevo en madre. Entonces comenzar a colocar el cuerno uterino derecho de nuevo en madre a partir de la más lejana sáculo embrión de la vagina en el cuerno y se mueve hacia abajo. Continúe hasta que sólo dos embriones permanecen expuestos (Fifigura 4). Por último, los embriones de posición en una columna anterior y paralela a la línea de incisión, siendo consciente de no cortar la circulación uterina. </li><li> Coloque bloques de arcilla y posición entre los brazos y el cuerpo, así como las piernas y la cola. Asegúrese de que las superficies de arcilla son aproximadamente la altura de laparotomía. Moje la placa de Petri fenestrado con 37 ° C PBS. </li><li> Agarre extienden fórceps con la mano derecha y el plato de Petri fenestrado con la mano izquierda (fenestración paralelo a los embriones) y llevar cerrado fórceps ~ 5-cm a través de la fenestración, desde la parte superior de la placa de Petri. Fórceps abierto completamente sin desgarrar la malla fenestración. </li><li> Maniobra manos por encima de los embriones y enfocar la vista en los dos sáculos embrión. Sin (o poco) tocando sáculos con mallado fenestración o fórceps, deslice a través de ranura y fija una placa de Petri en el abdomen de la madre. Con pinzas todavía extendidos, manipular malla fenestrado para asentarlo en ambos lados y en la base de cada embrión (Figura 5 </strong&gt;) y tire de pinzas de apertura de hendidura. </li><li> Luego, coloque goma azul que contiene la pared en una placa de Petri, sin pellizcar o dañar embriones (Figura 6). Hacer bloques de arcilla estén equilibrando firmemente placa de Petri, embrión, y la pared que contiene goma. Por último, llenar el plato de Petri con 37 ° C PBS hasta que los embriones se sumergen por completo (Figura 6), mientras que el control de fugas en el mallado fenestrado. </li></ol> Procedimiento 3. Inyección <ol><li> Etapa de inyección inferior con la madre y embriones abajo utilizando la perilla de ajuste de nivel Z (Figura 1) y luego gire la aguja de inyección y montaje en brazo y se alinea directamente con sonda de ultrasonido, con ½ aguja cm a la izquierda y debajo de la punta de la sonda (Figura 7) . Empuje aguja-brazo (no de la aguja) 45 ° lejos de la sonda. Tenga cuidado de no golpear la punta de la aguja con la sonda plato o una ecografía. </li><li> Levante etapa de inyección de nuevo a la altura original, con ultrasonido pbata directamente encima de la sonda embriones debe estar sumergida ligeramente y dentro de 3-4 mm de tejido embrionario. Utilice X &amp; Y mandos de ajuste etapa (Figura 8) para modificar la posición del embrión / madre / etapa de localizar sistemáticamente el corazón embrionario de latir. </li><li> Directamente Centro de pantalla del ultrasonido observar un objetivo central negro marcador dibujado (*). Busque ventrículo izquierdo (preferible) o atrio utilizando los botones de ajuste etapa X &amp; Y (Figura 8) y luego subir o bajar del escenario con el botón giratorio en la etapa de posicionar objetivo inyección con precisión sobre el marcador central negro en la pantalla del ultrasonido. </li><li> Utilice la perilla de ajuste etapa X para mover embrión hacia la derecha, fuera de la pantalla del ultrasonido. Vuelva a colocar la aguja de microinyección y el brazo en su lugar, ½ cm de distancia de y 90 ° a la sonda de ultrasonido (Figura 7). </li><li> El uso de microinyección montaje mandos de ajuste (Figura 9C-G), aguja posición con la punta claramente alDiseñada con el marcador central. Ajustar el ángulo de inyección (usando perillas en la figura 9C y EG), y X, Y, Z y vectores de micro-aguja para asegurar punta de la aguja se centra en el plano correcto. Repliegue aguja de microinyección usando únicamente el mando de &quot;inyección&quot; (Figura 9F), cuidado de no ajustar otras dimensiones. </li><li> De nuevo, usando únicamente el ajuste fino perilla etapa movimiento embrión X de nuevo bajo la sonda, con la meta exactamente en el punto central de la pantalla del ultrasonido. Asegúrese de que el ventrículo izquierdo es ahora exactamente en la misma X, Y, y Z avión. </li><li> A continuación, con montaje sólo la perilla de &quot;inyección&quot; en la microinyección, perfore lentamente embrión con la aguja de microinyección y llevar lentamente la punta hacia el ventrículo izquierdo. Inyectar la totalidad de 2,5 l de solución TL en el ventrículo izquierdo o hasta que suena la señal vacías, mediante la celebración de &quot;vacío&quot; y pulsando &quot;llenar&quot; una vez (Figuras 2A y B). En este momentode la inyección observar una sombra que emana de la punta de la aguja que es el TL entrar en la cámara cardiaca (Figura 10). A la inversa, retraer rápidamente aguja de microinyección girar la &quot;inyección&quot; perilla (Figura 9F) en la microinyección se monta cuando la inyección se ha completado. </li><li> Continúa en el próximo embrión y repita este procedimiento para los embriones restantes que siguen esta serie de pasos y finalmente colocar los embriones finales de nuevo en el abdomen de la presa. Cambie la anestesia a la caja de la cámara y mover suavemente madre aquí durante 15 minutos desde el momento de la última inyección. </li></ol> 4. La recolección de embriones y Análisis <ol><li> Sacrificar presa a través de la dislocación cervical. Ampliar la laparotomía para eliminar fácilmente los cuernos uterinos de la madre. Mantener los embriones dentro de saco uterino. Coloque embriones en PBS enfriado. </li><li> Diseccionar embriones de saco uterino (si el tejido cobrar necesaria para el genotipado) y coloque todo el embrión in 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche, y luego en el 30% de sacarosa durante la noche, se congele en criostato seccionar medio. A continuación, corte la criosección y colocarlo en portaobjetos para el análisis inmunohistoquímico. Opcionalmente, utilice toallitas para todo el montaje por deshidratación en el 100% de metanol, después de la fijación en el 4% PFA. </li><li> Para el análisis inmunohistoquímico colocar los cryosections en PBS para eliminar la OCT. Entonces bloquear las secciones con 10% de suero normal de burro durante 30 min. A continuación, agregue PECAM anticuerpo primario a dilución 1: 100 la noche a 4 ° C. Al día siguiente, se lavan los portaobjetos en PBT 3 veces durante 10 minutos cada uno y agregar burro anti rata 594 secundaria e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. NOTA: Esta es una técnica muy exigente que requiere la optimización y coordinación de la ecografía y la microinyección. Hay una curva de aprendizaje muy grande en relación con esta técnica y requiere cuatro a seis semanas de inyecciones mentor antes de que uno se convierte en dominio. </li></ol>

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	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anestesia Microinyección y marco de tiempo Con respecto a la anestesia de la madre, es esencial para mantener constante el flujo de aire (2-3 L / min) y a baja PSI. El flujo del sedante debe mantenerse a aproximadamente 1,75 a 2 L / min. Al mismo tiempo, los plazos en que las inyecciones se realizan deben ser monitoreados y controlados para con cada camada de cerca. Para cada camada el procedimiento de inyección debe mantenerse en 45 min. La importancia de este límite de tiempo es de suma...

Durante el desarrollo embrionario dos procesos discretos, pero simultáneas, vasculares tienen lugar: la angiogénesis, el proceso por el cual un recipiente crece de un vaso principal, y la vasculogénesis pre-existente, que es una formación de novo de los vasos a partir de progenitores endoteliales residenciales 1,2. Respectivamente, el primero es sinónimo de flujo de sangre, mientras que el último se cree que tener lugar en gran medida en ausencia de la misma. Simultáneamente a la formación de vasos sanguíneos, un proceso cíclico y dinámico de la síntesis renal de células progenitoras, la proliferación y la diferenciación comienza a desarrollarse en el día embrionario 9,5 (E9.5). En este punto la yema ureteral (UB) invade dorsal en los alrededores mesénquima metanéfrico (MM), y continúa hasta el nacimiento 3. Repetida de ramificación de la UB en condensación rápidamente mesénquima metanéfrico tapa comienza la formación de las unidades funcionales del riñón, la nefrona. Con cada nueva generación de la UB y nephron, las generaciones mayores son desplazados en regiones corticales y medulares interiores, donde luego se someten a más de maduración y diferenciación dentro de los entornos principalmente vascular-densos. Como se desprende de Dressler et al., 3, este proceso embriológico se precipita por la señalización inductiva, como diafonía entre UB y MM, y una miríada de factores extracelulares 3-6. Dos factores extracelulares recientemente investigados dentro del páncreas y los riñones incluyen el desarrollo de la tensión de oxígeno y el flujo sanguíneo 7,8. Este último será discutido en más detalle a continuación en relación con el desarrollo del riñón. Con el fin de exponer el papel inductivo que el flujo sanguíneo potencialmente juega en la diferenciación de células progenitoras nefrona, así como en otros procesos de organogénesis, métodos precisos y exactos de mapeo de flujo de sangre embrionaria es imprescindible. Los métodos alternativos para medir el flujo sanguíneo incluyen la prescripción de ultrasound de imágenes y resina yesos 9,10. En conclusión, estos modos se ha demostrado que ser inherentemente carente de su capacidad para dar a conocer simultáneamente yuxtaposiciones temporales y espaciales entre el flujo sanguíneo y diferenciación de células madre. Moldes de resina, por ejemplo, proporcionan un modelo válido de patrón embarcación dentro de los tejidos adultos, sin embargo en los vasos inmaduros, como con los puntos de tiempo embrionarias, los vasos son muy poco desarrollado y con goteras. Por lo tanto, la resina arroja fallar para mantener dentro de los vasos pequeños, a menudo porosa. Por estas aparentes obstáculos, entre otros, se optó por incorporar guiada por ultrasonido vivo intra-cardíacos lectina de tomate embrionario (TL) en microinyecciones en nuestras investigaciones sobre el desarrollo del riñón. En este procedimiento utilizamos una sonda de ultrasonido para guiar sincrónicamente una aguja montada micropipeta llena con 2,5 l de solución de TL en el ventrículo izquierdo de embriones de ratón en los puntos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 y de tiempo. E170.5 es la última edad de desarrollo como las agujas no son lo suficientemente fuertes como para penetrar en el embrión más desarrollado. Las ventajas de este método de microinyección son abundantes. Microinyección guiada por ultrasonido permite la colocación precisa de una aguja de inyección dentro del ventrículo izquierdo embrionario, la expulsión pasiva y controlada de solución en el corazón de la animal, un daño mínimo al corazón y los tejidos circundantes, y la evitación de la insuficiencia cardiaca súbita y la muerte de la embrión antes de la perfusión de todo el cuerpo. Con el uso de un TL marcado con FITC, cualquier vasculatura perfundido mantendrá el marcador a lo largo de su membrana apical endotelial. En combinación con la inmunohistoquímica, utilizando Pecam (CD31, plaquetas molécula de adhesión celular endotelial) y varios otros marcadores vasculares, somos capaces de distinguir claramente entre los vasos perfundidos y un-perfundido, así como caracterizar cualquier tinción aberrante de los tejidos circundantes.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

La formación y la perfusión de desarrollar vasos sanguíneos renales (aparte de los glomérulos) han sido poco estudiados en gran medida. Como vasculatura se desarrolla a través de la angiogénesis (la cual es la ramificación fuera de los grandes vasos) y vasculogénesis (de novo la formación de vasos), técnicas de mapeo de perfusión como moldes de resina, vivo de imágenes de ultrasonido en y micro-disección se han limitado en la demostración de las relaciones íntimas entre estos dos procesos y estructuras renales en desarrollo en el embrión. Aquí se describe el procedimiento de In Utero intra-cardíacos guiadas por ultrasonido marcados con FITC microinyecciones lectina de tomate en embriones de ratón para medir la ontogenia de la perfusión renal. Tomate lectina (TL) se perfundió todo el embrión y los riñones cosechado. Los tejidos fueron co-teñidos para diversas estructuras renales que incluyen: progenitores nefrona, estructuras nefrona, el epitelio uretral y la vasculatura. A partir de E13.5 vasos de gran calibre se perfundieron, sin embargo periféricavasos permanecieron no perfundido. Por E15.5 y E17.5, pequeños vasos periféricos, así como glomérulos comenzado a ser perfundido. Esta técnica experimental es fundamental para estudiar el papel de la vasculatura y el flujo sanguíneo durante el desarrollo embrionario.

Formación Vascular precede flujo en el desarrollo del riñón Una mayoría de tejido embrionario (incluyendo el riñón) contiene una vasculatura densa (ambos no perfundido y perfundidos), incluso en los primeros puntos de tiempo embrionarias. Para un mejor calibre y analizar el flujo de sangre dentro del riñón en desarrollo se utilizó un método de In Utero microinyecciones intracardiaco embrionarias. Con el uso de un ultrasonido de alta resolución para identificar el corazón embriona...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

En Utero Inyecciones intra-cardiaca-lectina de tomate en embriones de ratón para medir el flujo sanguíneo renal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K vistas.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Inmunología e Infección

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Medicina

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

La ecocardiografía fetal murino

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenosa y Intra-amniótico en el útero el trasplante en el modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...