Name: derivation of t cells in vitro from mouse embryonic stem cells
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

We thank Joon Kim for expert flow cytometry assistance. Research in the authors&#8217; labs is supported by the SCORE program of the National Institutes of Health (grant SC1-GM095402 to B.D.O) and the Canadian Institutes of Health Research (to J.C.Z.P.). J.C.Z.P. is supported by a Canada Research Chair in Developmental Immunology. The biomedical research infrastructure of Hunter College is supported in part by the NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) program via grant MD007599. We also acknowledge the New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) for its support of the initiation of stem cell research at Hunter College via grant C023048.

1 Preparación de medios de cultivo, citoquinas y Placas gelatinizada <ol><li> Preparar los medios de comunicación de células ES mediante el uso de Modificación de Medio de Eagle (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio. Añadir 20% ESC Calificación suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% Tampón HEPES, ácidos 1% para no esencial amino, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) y 0,1% ( 55 M) β-mercaptoetanol. Esterilizar medio de células ES por filtración. </li><li> Preparar medios OP9 al hacer 1 L de medio esencial mínimo alfa (α-MEM) a partir de polvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina. Invertir para mezclar. Esterilizar por filtración en dos alícuotas de 500 ml. NOTA: Se recomienda el uso de medios elaborados a partir de polvo y es probable que para producir un mejor mantenimiento de células OP9 y en los resultados de diferenciación in vitro. Este enfoque se ha convertido en nuestro procedimiento estándar. Sin embargo, también observamos That hemos utilizado a veces líquidos pre-hechos α-MEM con éxito adecuada. </li><li> Preparar medio de congelación mediante la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 90% de FBS. Agitar suavemente y esterilizar por filtración. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 2,000x Flt-3 ligando (10 g / ml) por disolución de Flt-3 humana recombinante ligando (Flt-3L) en medios OP9 completa a 10 g / ml. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor respecto a la estabilidad y el almacenamiento. NOTA: La estabilidad de Flt-3L es corto (1 mes a 4 ° C o 3 meses a -80 ° C). </li><li> Preparar 1,000x IL-7 (1 g / ml) mediante el uso de medios de comunicación OP9 completa. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor sobre la estabilidad y almacenamiento (IL-7 es estable por hasta 12 meses a -80 ° C). </li><li> Preparar 1,000x Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) (10 g / ml) por una dilución 1:10 de 10 7 unidades de LIF in medio de células ES. Alícuota Almacenar a 4 ° C. Asegúrese de anotar la fecha de caducidad indicada por el fabricante en los viales alícuotas. NOTA: El producto es estable en forma concentrada o diluida al menos 18 meses a partir de la fecha de fabricación. </li><li> Preparar placas de 6 pocillos gelatinizados por añadir 1,5 ml de 0,1% de solución de gelatina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Deja los platos en la campana estéril a temperatura ambiente con las tapas en, dejando al menos 30 minutos para el recubrimiento. Los platos también se pueden dejar en una incubadora humidificada durante la noche. Retire cualquier solución de gelatina sobrante justo antes de la siembra de células. No deje que la solución de gelatina se seque por completo en el pozo. </li></ol> 2 Preparación y mantenimiento de células alimentadoras y las células madre embrionarias de ratón (mESC) NOTA: Incubar todas las células en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2. <ol><li> Descongelación fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) <ol><li> Quick-descongele un vial congelado (~ 5 x 10 6 </sup&gt; células / vial) de mitomicina C-tratado (o de otra manera detenidas mitóticamente MEFs) y los transfieren a un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 8 ml de medio de células ES a las células descongeladas, de una manera gota a gota para diluir gradualmente el DMSO a partir del medio de congelación. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio de células ES. </li><li> Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml con 33 ml de medio de células pre-calentado ES. Añadir los 3 ml de MEFs resuspendidos a llevar el volumen final a 36 ml. </li><li> Distribuir 3 ml de los MEFs resuspendidos en cada pocillo de dos placas de 6 pocillos gelatinizado. Colocar las placas en la incubadora durante al menos seis horas para permitir que las células se unan y se extienden antes de la siembra de las mESCs en ellos. Estas capas alimentadoras mitóticamente detenidas pueden ser utilizables durante varios días después de la siembra inicial, si sus medios se cambian cada 2-3 días. NOTA: MEFs recién detenidos también se pueden utilizar. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> MESCs Siembra <ol><li> Quick-descongele un vial con un congelado clon mESC en el baño a 37 ° C y preparar las células como se describe en 2.1.1-2.1.3. NOTA: Nos congelamos 2 viales de mESC de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos. </li><li> Retire el medio de un pozo (por clon mESC) de la placa de 6 pocillos con monocapas MEF detenidos (preparado en el paso 2.1.5) y sembrar el 3 ml de mESCs en la parte superior de la monocapa MEF. Añadir 3 l de 1,000x LIF (10 ng / ml). Volver platos en la incubadora. </li></ol></li><li> El mantenimiento de células ES y la tripsina mediada pasaje NOTA: Cambiar medios diarios o Split basado en la confluencia de mESC. En condiciones óptimas, la cosecha y de división / re-placa de las células cada dos días. <ol><li> Retire el medio de células ES y lavar mESCs con 2 ml de PBS. Retire PBS. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 3-5 min. </li><li> Recoger las células tratadas con tripsina y transferirlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Pipetear vigorosamente la suspensión celular a romper los grumos de mCES. Añadir 2 ml de medio de células ES completa a la suspensión celular para neutralizar la tripsina. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de células ES medios de comunicación. </li><li> Retire el medio de placas de 6 pocillos que contienen monocapas MEF detenidos preparados. Añadir la cantidad apropiada de la suspensión celular (basado en la relación de separación deseada) en 3 ml de medio de células ES a cada pocillo para sembrar. Añadir 3 l de LIF 1,000x. Una confluencia mESC bien dividida 1: 6 estará listo para el paso en 2 días. </li></ol></li><li> OP9 / mantenimiento de células OP9-DL1 <ol><li> Descongelar un vial de células OP9 (siga los pasos 2.1.1-2.1.3 utilizando medios OP9) </li><li> Añadir 7 ml de medio OP9 a 10 cm placa de cultivo tisular. Añadir los 3 ml de células resuspendidas en una forma gota a gota, la distribución de las células de todo el plato. Colocar las células durante la noche en la incubadora. </li><li> Compruebe la confluencia de las células OP9 al día siguiente. Si el plato contiene muchas células flotando muertos, remove los medios de comunicación y añadir 10 ml de medio OP9 fresco. Devuelva el plato a la incubadora si no se observa casi llena confluencia. Split (utilizando tripsina) 1: 4 cerca de la monocapa confluente OP9. NOTA: Las placas deben llegar a mismo nivel confluencia de nuevo en unos 2 días. Tenga cuidado de no dejar que las células OP9 vuelto sobre-confluente. </li><li> Congelar los primeros pasajes de células OP9 como acciones de expansión. NOTA: Nos congelamos 2 viales de células OP9 de una cerca de la confluencia placa de 10 cm. Cada vial de expansión de valores puede ser propagado a crear reservas de trabajo que se utilizan posteriormente en mESC experimentos de co-cultivo. Mantenga todas las existencias OP9 congelados en nitrógeno líquido y no en el congelador -80 ° C, ya que las temperaturas fluctuantes pueden influir negativamente en la calidad de las heladas. </li></ol></li></ol> 3. OP9-DL1 Procedimiento Co-cultura <ol><li> Preparaciones de Co-cultura <ol><li> Aproximadamente una semana antes de la iniciación de un co-cultivo, descongelar MEFs, mESCs y sto celular OP9 trabajocks. Dado que las células OP9-DL1 no son necesarios hasta el día 8 de co-cultivo, descongelar las células OP9-DL1 durante los primeros tres días después del inicio de co-cultivo. Mantener o congelar todas las células según sea necesario. </li><li> Determinar el número inicial de placas de 10 cm con monocapas de células OP9 preparados para alcanzar el 80% de confluencia en co-cultura día 0 en base a la escala del experimento (por ejemplo, número de clones mESC para diferenciarse y el número de puntos de tiempo de co-cultivo de ser analizada). Para prepararse para una co-cultura, dividido cerca plato confluente de células OP9 entre 1: 4 y 1: 6 dos días antes de que se necesitarán las monocapas. NOTA: Uno necesitará al menos una placa por clon ESC. Típicamente, un solo clon ESC sembró en una sola placa (como se describe a continuación) en el día 0 deben producir suficientes células para sembrar placas de seis días en el paso 5. Cada placa 5 días permitirá una posterior punto de tiempo de análisis. </li><li> Desde monocapas OP9 serán continuamente necesarios para el paso de co-cultivo, tenga cuidado de siempre maintaen un número adecuado de placas de cultivo de OP9 adicionales en paralelo con el co-cultivo. </li></ol></li><li> Día 0: Inicio de la co-cultura <ol><li> Recoger mESC como en 2.3.1-2.3.4. Contar las células. </li><li> Para cada clon mESC preparar 5 x 10 4 mESC en 10 ml de medio por placa OP9. NOTA: Aunque no hemos utilizado, observamos que un medio alternativo que consiste en α-MEM, el 10% de SFB, y 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol También se ha informado para el uso en la diferenciación de co-cultivos 10. </li><li> Eliminar los viejos medios de OP9 platos y añadir los 10 ml de suspensión mESC a los platos teniendo cuidado para distribuir las células uniformemente a través de la placa. Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora. </li></ol></li><li> Día 3: Cambio de medio <ol><li> Sacar los recipientes de la incubadora y observar bajo el microscopio. Las colonias deben comenzar a perder brillo y un aspecto apisonado. </li><li> Retire el medio de platos y añadir con cuidado 10 ml de fresco OP9medios de comunicación. </li><li> Devolver los platos de co-cultivo a la incubadora. Monitorear visualmente la formación de colonias de mesodermo, como todos los días para informar al momento de OP9 preparación monocapa alimentador para el siguiente paso (día 5), ​​que no debe llevarse a cabo hasta ~ 80-90% de las colonias mostrar visualmente mesodermo como morfología. Aplazamiento máximo de la etapa de transferencia de células 5 días es de 2 días. </li></ol></li><li> Día 5: La tripsina pasaje mediada con pre-chapado. NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. Proceda con los siguientes pasos sólo si los co-cultivos muestran visualmente las características que se describen en el paso 3.3.3 (ver resultados también representativos). <ol><li> Retire el medio de los platos de co-cultivo. Añadir 4 ml de PBS para lavar. Agitar el PBS y quitar. Añadir 4 ml de tripsina al 0,25% y colocar los platos en la incubadora de ~ 5 min. </li><li> Interrumpir la capa de las células tratadas con tripsina por pipeteo vigoroso, con cuidado de no introducir burbujas de aire excesivas, hasta que unhomogénea se logra, sobre todo sola suspensión celular. </li><li> Añadir 4 ml de medio OP9 completos y mezclar con la pipeta. Transferencia de células en un nuevo, vacío placa de 10 cm y el lugar en la incubadora durante 30 min para permitir que las células se adhieran OP9 al plato. Este paso de &quot;pre-chapado&quot; reduce el número de OP9 células transferidas a la siguiente etapa de co-cultivo. </li><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con células coladeras 40 micras. </li><li> Recoger las células no adherentes de la placa de pre-chapado y pasar a través del filtro de células en el tubo. Lave el plato suavemente con 6 ml de PBS y pasarla a través del mismo filtro, dejando las células OP9 unidos detrás. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 3 ml de medio OP9 completa. Contar las células. </li><li> Retire el papel de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. </li><li> Para cada punto de tiempo de análisis, sembrar 5 x 10 5 células en el mono OP9capa en volumen final de 10 ml. </li><li> Añadir 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L y colocar los platos en la incubadora. </li></ol></li><li> Día 8: hematopoyético de células progenitoras (HPC) de recogida NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con monocapas OP9 o-DL1 OP9 celulares para que puedan ser ~ 80% de confluencia en el tiempo para este paso. <ol><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores. </li><li> Quitar los platos de la incubadora y observar bajo el microscopio. Grupos brillante de HPC deben ser débilmente unidos a la monocapa OP9. Recoger la mayor cantidad de estas células como sea posible mediante el lavado (pero no demasiado interrumpir) la monocapa OP9 con una pipeta y los medios de comunicación existentes en el plato. Para evitar la formación de espuma, siempre dejar al menos 1 ml de los medios de comunicación en la punta de la pipeta durante esta colección HPC / paso de lavado. </li><li> Pasar las células a través del filtro de 40 micras en un tubo. Añadir 8 ml de PBS a la misma placa y comprobar bajo el microscopio si todos nos HPCsre recogido. Repita el paso de lavado / colección con PBS y (si es necesario) con el lavado más enérgico. Colar las células en el tubo ya que contiene las células de la misma placa. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Preparar una mezcla maestra de 3 ml (por placa sembró en el día 5) de los medios de OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios OP9 con Flt-3L + IL-7 mezcla maestra (3 ml por cada placa de 10 cm procesado). Transferencia de las células recogidas de cada placa en un pocillo de una placa de 6 pocillos con células OP9. <ol><li> Con el fin de conducir hacia las células monocíticas, células B o linajes eritroides, sembrar las células recogidas en las células OP9. Para derivar células T, sembrar las células en monocapas de células OP9-DL1. </li></ol></li><li> Coloque las placas de 6 pocillos en incubadora. </li></ol></li><li> Día 10: Cambio de medio <ol><li> Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinto mESC clon-alimentador tipo de células combición en co-cultivo. </li><li> Preparar una mezcla maestra de los medios OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada pocillo. </li><li> Recoger suavemente los medios de comunicación de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que combina los medios de comunicación de múltiples pocillos que contienen el mismo clon de alimentador de tipo de célula combinación ESC. </li><li> Añadir 2 ml de mezcla maestra medios OP9 (véase 3.6.2) en cada pocillo. </li><li> Centrifugar los medios de recogida a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet (muy pequeña si es visible) en 1 ml de OP9 maestro de la mezcla de medios (ver 3.6.2) por pocillo recogido inicialmente en el paso 3.6.3. </li><li> Distribuir 1 ml de células de nuevo en cada pocillo de la que los medios de comunicación se recogió originalmente llevando el volumen en cada pocillo a 3 ml. Vuelva a poner las placas en la estufa. </li></ol></li><li> Día 12: Ningún pasaje tripsina NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con células OP9 o OP9-DL1 para que puedan ser confluentes de manera óptima en el tiempo para este step. Día 12 es ideal para el análisis de citometría de flujo de eritroide en desarrollo, monocitos y células T en fase inicial. <ol><li> Preparar una mezcla maestra (3 ml para cada pocillo que continuará en co-cultivo) de los medios de comunicación OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores (uno para cada clon-alimentador tipo de célula combinación ESC en co-cultura). </li><li> Vigorosamente pipetear los medios de comunicación existentes en cada pocillo para desagregar todas las células (incluyendo la monocapa) en el pozo. Continuar con pipeteo enérgico hasta que se alcanza un estado parecido a una suspensión de células individuales. </li><li> Pasar las células recogidas a través del filtro en el tubo. Añadir 3 ml de PBS en cada pocillo para lavar y recoger todas las células restantes. Pasar las células a través del mismo filtro. Combinar celdas de múltiples pozos que contienen el mismo clon-alimentador tipo de célula combinación ESC. </li><li> Desechar el filtro de células utilizado y eliminar una parte alícuota equivalente a un pocillo (~ 6 ml) para cualquier deseadacitometría de flujo (u otro) análisis a realizar en ese día. Guarde estas alícuotas en hielo antes de su uso. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de los tubos de centrífuga de 50 ml en 3 ml de mezcla maestra por pozo a ser re-sembrado. Añadir 3 ml por pocillo de cada suspensión de células en el tipo de células de alimentación apropiada y colocar los platos en la incubadora. </li></ol></li><li> Día 14: Cambio de medio <ol><li> Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6. </li></ol></li><li> Día 16: Ningún pasaje tripsina NOTA: Preparar con antelación placas de 6 pocillos de células OP9 o OP9-DL1 óptimamente confluentes para este paso. NOTA: El día 16 es ideal para el flujo de análisis de citometría de los linfocitos B y las células T de la etapa intermedia. <ol><li> Siga los pasos descritos en la sección 3.7. </li></ol></li><li> Día 18: Cambio de medio <ol><li> Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6. </li></ol></li><li> Día 20: Ningún pasaje tripsina NOTA: Día 20 is ideal para citometría de flujo análisis de mediados o finales de etapa de desarrollo las células T. <ol><li> Siga los pasos descritos en la sección 3.7. Si lo desea, realizar la diferenciación de células día 20 cambio de medio alterna pasado y no tripsina pasajes cada dos días con un seguimiento diario de la tasa de expansión de los linfocitos. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro.">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li><li>Pui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+expression+in+early+lymphopoiesis+influences+B+versus+T+lineage+determination.">Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination.</a> Immunity. 11, 299-308 (1999).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1101 (1994).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro.">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li><li>Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-2-deficient+blastocyst+complementation:+an+assay+of+gene+function+in+lymphocyte+development.">RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).</li><li>de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cell-derived+prehematopoietic+progenitors.">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors.</a> Blood. 102, 1649-1653 (2003).</li><li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+autophagic+protein+beclin+1+early+in+lymphocyte+development.">A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development.</a> J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).</li><li>Lahiji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+TCR-alpha+gene+locus+control+region+activity+in+T+cells+derived+in+vitro+from+embryonic+stem+cells.">Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells.</a> J Immunol. 191, 472-479 (2013).</li><li>Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+embryonic+stem+cells+into+endothelial+cells+in+an+in+vitro+model+of+vasculogenesis.">Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.</a> Blood. 93, 1253-1263 (1999).</li><li>Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+lineage+analysis+by+cell+sorting+and+culture+identifies+FLK1+VE-cadherin++cells+at+a+diverging+point+of+endothelial+and+hemopoietic+lineages.">Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages.</a> Development. 125, 1747-1757 (1998).</li><li>de Pooter, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+requires+GATA-2+to+inhibit+myelopoiesis+from+embryonic+stem+cells+and+primary+hemopoietic+progenitors.">Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors.</a> J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).</li><li>Watarai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+NKT+cells+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+bearing+rearranged+invariant+Valpha14-Jalpha18+TCRalpha.">Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha.</a> 115, 230-237 (2010).</li><li>Pipkin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+transfer+activates+and+delineates+a+locus+control+region+for+perforin.">Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin.</a> Immunity. 26, 29-41 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El sistema OP9-DL1 de co-cultivo se ha utilizado para estudiar el papel de los diversos productos de genes durante el desarrollo de tipos de células sanguíneas a partir de células madre. 8,12,13 También ha demostrado ser un modelo eficaz para estudiar la función del ADN reguladora del gen durante la diferenciación celular. 9,14 Con este enfoque como una alternativa a los modelos enteros de ratón puede producir un considerable ahorro en tiempo y coste de los experimentos que abordan muchas cuestiones básicas en la hematopoyesis. Sin embargo, la adaptación de este protocolo para estos fines requiere conocimiento del potencial de variabilidad entre clones mESC que serían utilizados en estos procedimientos. La línea de tiempo del protocolo publicado es esperable a partir de la media, en buen estado, línea mESC no manipulada. 7 Además, los clones mESC seleccionados para la generación de ratones quiméricos por lo general son de mayor calidad y llevará a cabo muy robusta en OP9 co-cultura . Por otro lado, los clones mESC emergente directamente desde establestransfección con un transgén ectópica integrado mostrará diversos grados de eficiencia diferenciación inicial que van de medio a medio por debajo. El protocolo descrito aquí proporciona un retraso estratégica 1-2 días de la etapa de paso de 5 días para igualar estas diferencias potenciales antes de la inducción de la hematopoyesis in vitro. El paso día 8 es el paso en el que la ejecución de este protocolo tiene el mayor potencial para el error. La paciencia, la práctica y la observación cuidadosa le permitirá a uno para desarrollar la técnica que optimiza la cosecha HPC un mínimo de perturbaciones monocapa OP9. Más allá de las claves día 5 y el día 8 pasos, los parámetros críticos implican el mantenimiento meticuloso cultivo de células (particularmente células OP9, como se describió anteriormente) y especial atención a los reactivos utilizados en el protocolo. El reactivo más crítico es el FBS. Lotes distintos de FBS variarán notablemente en su capacidad para apoyar este procedimiento. Múltiples lotes deben ser probados en order para determinar que producirá robusta diferenciación en este ensayo. Este sistema de co-cultura tiene sus limitaciones. Por ejemplo, este modelo no es compatible con la diferenciación de células CD4 positivas individuales. Una razón para esto es la falta de expresión de complejo mayor de histocompatibilidad infraestructura de la presentación de antígenos (MHC) de clase II en las células OP9. Se requiere 1 de la célula de presentación de antígenos de superficie por MHC de clase II para el adecuado desarrollo de las células CD4 SP. Las células CD8 SP que hacen emerger representan una mezcla de fases de timocitos CD8 SP maduros e inmaduros. 1 Por otra parte, el éxito del trasplante de mESC deriva progenitores de células T en un ratón requiere aprobación previa a través de cultivo de órganos del timo fetal. 1 Sin embargo, esta tecnología ha demostrado su prometer como un poderoso enfoque de investigación a ambas preguntas celulares y moleculares en la sangre y el sistema inmunológico de desarrollo que antes eran sólo es posible explorar en vivo. De este modo, además de proporcionar una nueva forma de avanzar más rápidamente en estas preguntas, una adopción más amplia del sistema de co-cultivo OP9-ESC tendrá el impacto más amplio de reducir el uso de animales de experimentación.

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.1 This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.2 The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells3 with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).4 Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture &#8220;microenvironment&#8221; that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models5 and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.6 The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals. 
We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.7 We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos8 and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.9 We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this &#8220;day 5&#8221; passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Stem cell qualified FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &amp;mu;m PES membrane</td></tr><tr><td>Cell Culture Grade Water</td><td>Corning</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12000-022</td><td>Powder, reconstitute per manufacture recommendation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>Testing of individual lots required&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Flt-3 Ligand</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Utrapure water with 0.1% gelatin</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEFs mitomycin C treated</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>Any mitotically arresteded MEFs can be used</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40 &amp;mu;m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6-well</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>Tubes for FACS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ES R1 cells</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td></td></tr><tr><td>OP9 cells</td><td></td><td></td><td>Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).</td></tr><tr><td>OP9-DL1 cells</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Cells can be requested from the Z&amp;uacute;&amp;ntilde;iga-Pfl&amp;uuml;cker laboratory.</td></tr><tr><td>FlowJo software&amp;nbsp;</td><td>Tree Star</td><td></td><td>FACS data analyses</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab</td></tr></tbody></table>

derivation of t cells in vitro from mouse embryonic stem cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Cuando se cultiva en MEFs en presencia de LIF, mESCs se pueden mantener en un estado indiferenciado. Bajo condiciones ideales, aparecen como colonias compactas de células rodeadas por un halo brillante en la microscopía de contraste de fases (Figura 1). Estos cultivos deben ser monitoreados diariamente. Dependiendo de la confluencia de las células, los medios de comunicación pueden ser cambiados o células se pueden dividir. Vecinas colonias mESC no deben llegar al punto de contacto entre sí. Un cultivo normal y saludable de mESCs indiferenciadas es un punto de partida esencial para la diferenciación in vitro de células T. Al iniciar el co-cultivo, se recomienda que las células sean totalmente confluente sin estar abarrotado. Esto es por lo que la mayoría de las células cosechadas para la siembra de células en monocapas OP9 son mESC (en lugar de células de alimentación). Si se observan grandes diferencias en la confluencia entre los diversos clones mESC ser diferenciados en el día 0, entonces sería mejor para eliminar MEFs por pre-adhesión a tisplacas de cultivo sue (como en el paso 3.4.3-3.4.6 utilizando los medios de comunicación completa de células ES) antes de contar los mESCs para co-cultivo de siembra. OP9 células deben estar en buen estado antes de la iniciación de co-cultivo (como se describe en la sección 2.4). Además, se piensa que OP9 células pierden algunas de sus propiedades con el cultivo prolongado y / o aumentos pronunciados en su tasa de proliferación 7 Evitar relaciones de división más allá de 1:. 5 durante el mantenimiento de OP9 células, y descartando las culturas OP9 continuos después de seis semanas, ayudará a evitar estas trampas. En la siembra de células y de transferencia de células pasos iniciales del co-cultivo (días 0, 5, 8, 12, 16), las monocapas OP9 deben estar dentro de una gama óptima de confluencia. Figura 2 muestra la baja (Figura 2A) y alta (Figura 2B), extremos de la gama de OP9 confluencia celular recomendable para su uso en forma de monocapas de co-cultivo. Un ejemplo de una placa de sobre-confluentes se muestra en la figura2C Ure. El no mantener confluencia óptima puede inducir la formación de adipocitos (Figura 2D) que, en grandes cantidades, pueden afectar negativamente a la co-cultura. En el día 0, el co-cultivo se inicia en OP9 células en lugar de OP9-DL1 células desde la formación del mesodermo se ve favorecida en OP9 células. Las células se sembraron en OP9-DL1 monocapas de células que comiencen a 8 días para inducir la producción de células T. Mientras que algunos clones mESC mostrarán visualmente (~ 90%) la formación robusta y cuantitativo de las colonias-mesodermo como por día 5 de co-cultivo (Figura 3A-B), otros pueden mostrar retrasos en este paso (Figura 3C-F). Bajo el microscopio, las colonias-mesodermo como derivados en este ensayo se han descrito de forma variable como parecido a las ruedas de carro o cráteres (Figura 4A) o, halos o floretes (Figura 4B). Si bien el protocolo OP9-DL1 publicado refleja una norma de forma cuantitativa mesodermoción para el día 5 de co-cultivo, 7 nos encontramos con que no todos los clones ESC alcanzar esa norma dentro de este marco de tiempo. En estos casos, se cambia el medio en el día 5 y esperar otros 1-2 días antes de realizar el protocolo de &quot;día 5&quot; cosecha de células / transferencia. El objetivo de este retraso es permitir ~ 80-90% de las colonias de células madre embrionarias para convertirse mesodérmico visualmente antes de la transferencia. Es importante aclarar que esta cifra refleja un 80-90% discernible estrictamente visual criterio por el contraste de fase sencilla inspección microscópica de la morfología de colonia en los platos de co-cultivo. Se refiere sólo a la proporción de colonias que se asemejan a las ESC se muestra en la Figura 4. Es posible que algunos clones DESC no alcanzarán este criterio visual, incluso después de un retraso de dos días. En tal caso, es posible enriquecer la sangre para formar precursores mesodérmicos utilizando citometría de flujo para la clasificación de células Flk-1 + células, como se ha descrito anteriormente. 6,11 En cualquier caso, para la sake de conveniencia nomenclatura, que &quot;reajustar el reloj&quot; y se refieren a la fecha de transferencia de colonias de mesodermo como como &quot;día 5&quot; Cuando varios clones ESC se diferencian en paralelo, es posible que algunas co-cultivos estarán listos para el día 5 en el paso del tiempo, mientras que otros van a la zaga. En este caso, es recomendable para retrasar el paso de todos los co-cultivos hasta que los clones más lentas alcanzar a los otros. El retraso no parece hacer ningún daño a los &quot;a tiempo&quot; co-culturas, pero beneficia a la posterior diferenciación de los clones más lentas mucho. Día 8 (es decir, tres días después de la transferencia de colonias mesodérmico) ve la aparición y acumulación de HPC. HPC son visibles como grupos brillantes de células que se adherían débilmente a las células alimentadoras OP9 (Figura 5). Un procedimiento de lavado cuidadoso, utilizando una pipeta y los medios de comunicación en el plato, se separará y recoger los HPCs dejandola monocapa OP9 su mayoría intacta (Figura 6A-C). Este es quizás el paso más sensibles a la técnica del protocolo. Toma algo de práctica para encontrar los movimientos adecuados y la presión de eyección de medios para lograr el equilibrio deseado de la cosecha máxima de HPC con una interrupción mínima de la capa de alimentación. Es aceptable si algo de la monocapa OP9 despega, ya que la mayoría de cualquier monocapa perdida será capturado en la malla de nylon 40 micras después de la filtración. Figura 6D muestra una monocapa después de pipetear excesiva conduce a una mayor alteración de las monocapas de lo necesario. Durante esta etapa de lavado, es importante comprobar bajo el microscopio o no se han recogido todas las HPCs, y ajustar la presión de lavado en consecuencia. El progreso de la co-cultivo se puede monitorizar mediante citometría de flujo. Para analizar específicamente la progenie hematopoyética no eritroide de la ESC, es importante primera puerta en las células CD45 + en vivo.Este paso impide la entrada de las células OP9 de los análisis, mientras que el uso de DAPI u otro colorante de tinción nuclear permite la exclusión de células no viables. Durante el día 12, muchos grupos de células pequeñas, redondas y brillantes deben ser visibles. No es necesario contar las células en esta etapa. Sin embargo, hemos observado que vivir, evento cuenta citometría de flujo cerrada están típicamente en el rango de 1-3 x 10 5 por día 12 co-cultura también. La citometría de flujo análisis de las células vivas cerrada diferenciadas en la monocapa OP9 producirá eritroide (NEG CD45, TER119 +) y monocitos (CD45 +, CD11b hi) linajes (Figura 7A). Los análisis de las células vivas, CD45 + diferenciadores en OP9-DL1 monocapas debe revelar marcadores característicos de CD4 / CD8 doble negación (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, neg CD4, CD8 neg) y DN2 (CD44 +, CD25 +, neg CD4, CD8 neg) células fase T (Figura 7B </stro<html> ng&gt;). Durante el día 16, hay un aumento significativo en la cantidad de células pequeñas, redondas, brillantes en las culturas. En OP9-DL1s, T productos de diferenciación celular progreso a la (neg CD44, CD25 +, neg CD4, CD8 neg) DN3 y DN4 (neg CD44, CD25 neg, neg CD4, CD8) neg etapas. Algunos DP (CD4 +, CD8 +) las células T también pueden comenzar emergente por día 16 (Figura 7B). HPCs sembró en OP9 células producen células B (CD19 +) por día 16 el día 20 de OP9-DL1-mESC co-cultivo, habrá grandes cantidades de células T y DP único positivo (SP) las células T CD8 + presentes ( Figura 7B). Figura 8 proporciona un diagrama que resume los pasos clave de los procedimientos anteriores, y los puntos de tiempo de análisis sugeridos durante el co-cultivo. ghres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Fase imagen de microscopía de contraste de mESCs indiferenciadas (colonias de bordes afilados) que crece en la parte superior de una monocapa MEF (aumento de 100X). <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2:.. Fase imágenes de microscopía de contraste de confluencia monocapa OP9 (A) (B) más altos niveles de confluencia aconsejables para co-cultivo pasaje / siembra (aumento 40X) (C) Ejemplo de un (ampliación sobre-confluente monocapa OP9 40X más bajo y ). (D) (magnificación Over-confluente monocapa OP9 200X) con la formación de adipocitos (grande, vesícula que contiene, células). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig3highres.jpg" /> Figura 3: Fase microscop contrasteimágenes Y de la formación de colonias-mesodermo como de &quot;día 5&quot; de co-cultivo. (A) Vistas 40X y (B) 100X de placas de co-cultivo con&gt; 90% diferenciación colonia mesodérmico. Estas placas están listas para el día 5 de paso. (CF) Ejemplos de placas Día 5 de co-cultivo que requieren 1-2 días aplazamiento antes de la transferencia (C &amp; E, magnificación de 40X, D &amp; F, un aumento de 100X). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig4highres.jpg" /> Figura 4: Fase de imágenes de microscopía de contraste de la variedad de formaciones de colonias mesodermo como en el día 5 de co-cultivo (A) La morfología de la colonia conocida como &quot;cráteres&quot; o (B) La morfología de las colonias que se refiere. &quot;Rueda de carro.&quot; como &quot;estelar&quot; o &quot;florecillas&quot; (aumento 200X). Figura 5. Fase imagen de microscopía de contraste de día 8 Placa de co-cultivo con racimos de pequeñas, HPCs brillantes, redondas sobre una monocapa OP9 (aumento 40X). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig6highres.jpg" /> Figura 6:.. Monocapa OP9 después de la recogida HPC en días de co-cultivo 8 (AC) gama apropiada de interrupción de la monocapa OP9 después de lavado cuidadoso para cosechar HPC (D) Un ejemplo de una monocapa OP9 que ha sido sobre-interrumpido por el día procedimiento de recogida 8 HPC. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig7highres.jpg" /> Figura 7: citometría de flujo Representante (FACS) analiza en particular los puntos de tiempo durantemESC diferenciación in vitro. (A) Tinción para eritroide (izquierda), monocítica (medio) y células B (derecha) los productos de mESC-OP9 co-cultivo en el día 12 o 16 como se indica. (B) tinción para el desarrollo de las células T en los puntos de tiempo indicados mESC-OP9-DL1 co-cultivo. Por favor, véase el texto para una descripción detallada de los inmunofenotipos. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52119/52119fig8highres.jpg" /> Figura 8 Diagrama de los pasos del procedimiento mESC-OP9 co-cultivo. (A) Los pasos clave de los primeros ocho días de co-cultivo de transferencia de células. El número aproximado de células sembradas en células OP9 en día se indican cero y cinco. (B) El paso de transferencia de los días 8 y los productos de diferenciación celular esperados detectados por citometría de flujo en los puntos de tiempo clave de co-cultivo. Por favor, véase el texto para una descripción detallada de los inmunofenotipos.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivación de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De células madre embrionarias de ratón

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

derivation-of-t-cells-in-vitro-from-mouse-embryonic-stem-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

10.9K vistas.  City University of New York. Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Video: Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Inmunología e Infección

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biología del Desarrollo

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Investigación sobre el cáncer

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

<meta charset="utf8"></head><body>Diferenciación de células Th17 a partir de células T CD4+ ingenuas mediante citometría de flujo

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Lograr la diferenciación in vitro de alta pureza de las células Th17 mediante la modulación de la concentración de citocinas

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Derivación de células T

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video