Name: detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
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The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the&#160;US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister&#8217;s Hope Foundation.

1. cultivo celular de EMT Inducción Nota: EMT puede ser inducida por tratamiento de TGF o la expresión ectópica de factores de transcripción Twist, Snail, o ZEB1 / 2 en las células epiteliales. Se describe en este protocolo es un sistema inducible EMT través de la expresión de la proteína de fusión Twist-ER en las células mamarias humanas inmortalizadas epiteliales (HMLE / Twist-ER, un regalo del Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Tras 4-hidroxitamoxifeno tratamiento (TAM), la proteína de fusión Twist-ER se transloca al núcleo para conducir la transcripción y los resultados en una transición EMT completa en 12-14 días 9,11,29. Sistemas inducibles EMT adicionales, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF, y MCF10A / TGF, se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores 11,30. <ol><li> Mantener células HMLE / desenroscables ER en mamaria medio de crecimiento de células epiteliales sin suero (MEGM) en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2. Pasaje de las células cada 2-3 días cuando llegan a 80% de confluencia. Se incuban las células con 0,15% de tripsina a 37 ° C durante 5-10 min, y después inactivar la tripsina con suero de ternera 5% / DMEM. Centrifugar las células y resuspender en MEGM. Células de la placa en una nueva placa de cultivo tisular en una proporción de 1 a 4. </li><li> Disolver TAM en etanol para preparar una solución 200 mM. Proteja TAM de la luz y almacenar a -20 ° C. Antes de su uso, recién añadir TAM en medios MEGM a una dilución de 1: 10.000 para hacer una concentración final de 20 nM TAM. </li><li> Para la inducción de la EMT, placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos por duplicado. Células de cultivo con medios 20 nM TAM-que contiene MEGM. </li><li> Placa células 1,6 x 10 6 HMLE / desenroscables ER en una placa de 10 cm por duplicado y el tratamiento de las células con etanol 0,01% como control no tratada con TAM. </li><li> Dos días después de la incubación, tomar fotografías bajo un microscopio de luz a un aumento de 10X para registrar los cambios morfológicos de las células. </li><li> Aspirar el medio de un plato de control o tratados con TAMcélulas. Lavar las células con PBS frío, y las células de la cosecha mediante el desguace de un medio de la placa en tampón de lisis de ARN para el aislamiento de ARN y la otra mitad en tampón RIPA para el análisis de proteínas. </li><li> Células pasaje del control o platos tratados con TAM en 1,6 x 10 6 células re-enchapado en una placa de 10 cm por duplicado. Continuamente tratar las células con 20 nM de TAM o vehículo. </li><li> Repita los pasos 5 a 7 una vez cada dos días hasta el día 14, momento en el cual, las células Twist-ER tratados con TAM muestran una morfología mesenquimal fusiforme, mientras que las células de control tratados con vehículo mantienen la morfología epitelial-adoquines similares. </li></ol> 2. Caracterización de EMT Nota: A la finalización de la EMT se indica mediante: (1) celulares cambios morfológicos de una morfología epitelial-adoquines como éste adopte un aspecto fibroblástico en forma de huso; (2) Pérdida de localización E-cadherina en las uniones célula-célula; y (3) La expresión de los marcadores de EMT de conmutación, que se define por la pérdidade marcadores epiteliales y ganancia de marcadores mesenquimales. Cambios morfológicos celulares son capturados por microscopio de luz a un aumento de 10X durante el curso del tiempo de la inducción de EMT, descrito en la Sección 1.-Immuno fluorescencia detección de E-cadherina en células uniones se describe en esta sección. La expresión de marcadores de EMT se detecta por inmunotransferencia. Marcadores epiteliales comunes son la E-cadherina, γ-catenina, y ocludina y marcadores mesenquimales incluyen fibronectina, N-cadherina y vimentina. Procedimientos generales de inmunotransferencia se describen en la Sección 4. <ol><li> En el día 12 del tratamiento TAM, semilla de 1 x 10 5 células en un 12 mm de vidrio cubreobjetos circular colocado en un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> 48 horas después de la siembra de células, medio aspirado y lavado con PBS precalentado. </li><li> Fijar las células con pre-calentado paraformaldehído al 4% durante 15 min. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 15min a TA. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células en 5% de BSA / PBS durante 1 hora a TA para bloquear la unión no específica. </li><li> Se incuban las células con el anticuerpo primario E-cadherina en una dilución 1:50 en 1% de BSA / PBS en una cámara humidificada O / N a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1:50 y 1: 200, y la dilución óptima para cada anticuerpo debe ser determinado experimentalmente. </li><li> Decantar el anticuerpo primario y lavar las células tres veces con PBS. </li><li> Se incuban las células con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia en una dilución 1: 500 durante 1 hora a RT. Desde este paso en, proteger las células de la luz. </li><li> Decantar el anticuerpo secundario y lavar tres veces con PBS. </li><li> Las células se tiñen con 0,1-1 g / ml DAPI o Hoechst durante 10 min. </li><li> Enjuagar las células con PBS tres veces. </li><li> Monte cubreobjetos con una gota de medio de montaje y cubreobjetos sello con esmalte de uñas. </li><li> Observar las células y tomarimages bajo un microscopio de fluorescencia 63X. </li></ol> La tinción con anticuerpos adicionales se puede realizar para confirmar el fenotipo EMT. Por ejemplo, N-cadherina y α-actina de músculo liso se pueden teñir para un 29,31,32 fenotipo mesenquimal. Reorganización de la estructura del citoesqueleto se puede controlar mediante tinción de las células con faloidina para F-actina 11. Además, los ensayos para la motilidad celular y la resistencia a la muerte celular se pueden realizar para examinar las propiedades de EMT 11. 3. Detección de Empalme isoformas utilizando ensayos de qRT-PCR <ol><li> Diseño Primer NOTA: Primer pares deben ser cuidadosamente diseñados para amplificar distintas isoformas de empalme. Omisión de exón, el evento splicing alternativo más comúnmente observado, se muestra aquí como un ejemplo para ilustrar la estrategia de diseño del cebador. Figura 1A representa una de cuatro exón pre-ARNm, con el tercer exón como un exón variable. La inclusión del exón 3 resultados enla producción de una isoforma de empalme más largo, mientras que la omisión del exón 3 genera una isoforma de empalme más corta. Los cebadores deben ser diseñados para distinguir la isoforma exón-3-y-incluido el exón 3-omitido isoforma, y ​​para detectar la transcripción de ARNm total de este. <ol><li> Para la detección de exón inclusión, diseñar cuidadosamente un cebador directo dentro de la variable de exón 3, y un cebador inverso en el interior del exón constitutiva cerca 4, lo que permite la amplificación específica de la isoforma exón-incluido variable. Asegúrese de no diseñar adelante y atrás primers dentro del mismo exón variable con el fin de evitar los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico o pre-mRNA. </li><li> Para amplificar específicamente eventos omisión de exón, diseño uno de los cebadores que abarcan la unión del exón constitutiva 2 y el exón 4 que de otro modo se destruye cuando el exón variable de 3 se incluye. Diseñar el otro cebador dentro del exón constitutiva 4. Como tal, los productos PCR se generan sólo cuando el exón variable de 3 es en excluired y la constitutiva posteriormente se unen exón 2 y el exón 4 juntos. </li><li> Para detectar los transcritos totales del gen, el diseño de los cebadores dentro de los dos exones constitutivos 1 y 2 Por lo tanto, los productos de PCR se amplificaron a partir de todas las isoformas. </li><li> Asegúrese de que la temperatura de fusión (Tm) para todos los cebadores es de aproximadamente 55 ° C, la longitud de cada cebador es de aproximadamente 18-22 nucleótidos, y el tamaño de los productos de PCR es de entre 80 y 150 pares de bases. </li></ol></li><li> La extracción de RNA: Extracto de ARN utilizando un kit de aislamiento total de ARN (véase la Tabla de Materiales). <ol><li> Recoger las células en 350 l de tampón de lisis de ARN. </li><li> Añadir 350 l de etanol al 70% al lisado y mezclar bien. </li><li> Transferir la muestra a la columna de purificación de ARN. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min y descarte de flujo a través. </li><li> Lavar la columna una vez con 500 l de tampón de lavado ARN I y dos veces con tampón de lavado II de ARN. </li><li> Retirar el tampón de lavado residual de ARNII de la columna por centrifugación a velocidad máxima durante 2 min. </li><li> Transferir la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml, añadir 50 l de agua libre de nucleasa en el centro de la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación a la velocidad máxima. </li></ol></li><li> Síntesis de la primera cadena de ADNc <ol><li> Determinar la concentración y la calidad del ARN mediante medición de la absorción UV. NOTA: Good ARN de calidad debe tener una relación de absorbancia / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0. </li><li> Configuración de la transcriptasa inversa (RT) reacciones que contienen 250 ng de ARN total 0,05 g cebadores hexámeros al azar, 50 pmol de MgCl 2, 10 pmol dNTP, 2 l 5 x tampón de goscript, y 1 l de la enzima RT en un volumen final de 20 l. </li><li> Realizar RT reacciones a 42 º C durante 1 hora, seguido de incubación a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la enzima RT. </li></ol></li><li> PCR en tiempo real <ol><li> Establezca 20 l reacciones que consisten en 10 l SYBR verde Master Mix,0,1-1,0 l molde de ADNc, y 5 pmol cebadores directo e inverso. </li><li> Ejecute PCR en tiempo real con 40 ciclos de los siguientes pasos: 95 ° C desnaturalización durante 10 segundos, 58 ° C recocido durante 10 segundos, y 60 ° C de extensión durante 30 segundos. Lleve a cabo reacciones de PCR por triplicado. </li><li> Compruebe curvas de disociación y asegúrese de que un solo pico se observa para cada grupo de cebadores. </li><li> Obtener los valores de ciclo de cuantificación (Cq) mediante el cálculo de los segundos valores derivados de curvas de amplificación. </li><li> Calcular la cantidad relativa (RQ) de ARNm diana en las muestras inducidas en comparación con la muestra no inducida a través del &quot;delta delta Cq (ΔΔCq) &#39;método como se muestra por la siguiente fórmula. Utilice los genes de limpieza, tales como GAPDH o PDD, como referencia. </li></ol></li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" /> Para calcular con mayor precisión los valores relativos de las isoformas de empalme, tl uso de múltiples genes de referencia debe ser considerada. Los resultados pueden ser analizados usando un método de cuantificación valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al 33,34. 4. Examen de Empalme Isoformas a nivel de proteínas <ol><li> Recoger las células en 100 tampón RIPA helada l. </li><li> Conjunto lisados ​​en hielo durante aproximadamente 10 min. </li><li> Centrifugar a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y recoger el sobrenadante. </li><li> Medir la concentración de proteína mediante ensayos de Bradford. </li><li> Diluir las muestras de proteína en tampón de carga SDS y cargar 20-40 g de proteínas en 10% geles de SDS-PAGE. </li><li> Ejecute geles SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas. </li><li> Proteínas de transferencia a membranas de PVDF en un sistema de transferencia húmeda a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajuste el tiempo de transferencia de acuerdo con el peso molecular de las proteínas diana. </li><li> Bloquear la membrana en la leche desnatada al 5% durante 30 min a 1 hora a TA. </li><li> Incubar wi membranath un anticuerpo primario a 4 ° CO / N. El rango de dilución de anticuerpo primario es normalmente entre 1: 200 y 1: 5000, determinar la dilución óptima para cada anticuerpo experimentalmente. La dilución de los anticuerpos utilizados en este protocolo se puede encontrar en la &quot;Tabla de reactivos y equipos específicos&quot;. <ol><li> Para detectar isoformas de empalme, utilizar anticuerpos específicos que reconocen una isoforma particular. Alternativamente, utilizar un anticuerpo que reconoce el epítopo en la región de codificación de exón constitutiva y detectar isoformas de empalme de forma simultánea sobre la base de sus diferentes tamaños de proteína. </li><li> Al mismo tiempo, controlar EMT por inmunotransferencia para los marcadores de EMT. Utilice E-cadherina, γ-catenina, y ocludina como marcadores epiteliales, y la fibronectina, N-cadherina y vimentina como marcadores mesenquimales. </li></ol></li><li> De membrana de lavado tres veces con TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) en un intervalo de 5 min. </li><li> Incubar la membrana con una hormiga secundario conjugado con HRPibody en una dilución de 1: 10.000 durante 1 hora a RT. </li><li> Membrana Lavar tres veces con TBS-T en un intervalo de 5 min. </li><li> Visualizar proteína con un sistema de detección de quimioluminiscencia y exponer la membrana a una película de autorradiografía. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

El procedimiento descrito aquí permite la detección de corte y empalme alternativo en un modelo inducible EMT. Como tales, las alteraciones dinámicas de empalme isoforma expresión pueden ser capturados durante todo el curso de tiempo de EMT. Este método tiene ventajas sobre el uso de diferentes epithelial- o líneas de células mesenquimales-que representa para la comparación de splicing alternativo debido a antecedentes genéticos distintos de líneas celulares no relacionados, podrían influir indebidamente en el splicing alternativo. Sin embargo, el éxito de la inducción de la EMT debe ser confirmada con cuidado utilizando varios marcadores EMT antes de sacar conclusiones sobre los cambios en el splicing alternativo se pueden extraer. Además, en adición al sistema de EMT Twist-ER-inducible se describe aquí, se recomiendan otros sistemas de EMT tales como los inducidos por Snail-ER o TGF para la validación de los resultados experimentales 11,30. La conmutación de isoformas de empalme durante EMT se puede detectar en ambos niveles de ARN y proteínas. Iso Spliceanticuerpos específicos de formulario que son los preferidos para el análisis de proteínas. Cuando los anticuerpos isoforma específica no están disponibles, los niveles de proteína de isoformas de empalme se pueden determinar en función de su peso molecular en SDS-PAGE por inmunotransferencia. El nivel de ARN de cada isoforma se puede cuantificar mediante cebadores isoforma específica. El uso de ensayos de qRT-PCR, el pliegue del cambio de cada isoforma puede ser determinado de manera sensible y precisa. En particular, cuando los materiales experimentales se limitan, como el análisis de la expresión de una isoforma de empalme especialmente en muestras clínicas, análisis de QRT-PCR proporciona una medida cuantitativa que compensar la falta de isoforma anticuerpos específicos para inmunohistoquímica. El método mencionado aquí es adecuado para la detección de cambios de isoformas de empalme conocidos durante EMT. Además, este método se puede ampliar para el estudio de corte y empalme alternativo de todo el genoma y para la identificación de la novela de conmutación isoforma de empalme durante la EMT. Para lograr esto,uso de una técnica a gran escala, tal como ARN profunda-Secuenciación de empalme o plataformas de microarrays sensible, podría llevarse a cabo utilizando ARN aislado a partir del modelo EMT inducible descrito anteriormente. Sin embargo, se requiere la validación qRT-PCR de los cambios de isoforma después de cualquier análisis a gran escala. En conclusión, corte y empalme alternativo se regula dinámicamente durante EMT, un proceso que es crítico para el desarrollo embrionario y la metástasis del tumor. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de corte y empalme alternativo en el genoma humano, es probable que la regulación del splicing alternativo desempeña un papel importante en muchos otros procesos biológicos y patológicos, incluyendo la diferenciación celular, el desarrollo de tejidos, y la muerte celular programada 35-41. El protocolo descrito en el presente documento para la detección de isoformas de empalme será aplicable a estos otros sistemas también. Modalidades experimentales adicionales, tales como ensayos minigene reportero de empalme, puede be utiliza para investigar más a fondo los mecanismos de regulación de los elementos que actúan en cis-y trans-actuando factores que controlan el splicing alternativo 30,42,43. Además, el papel funcional de una isoforma de empalme particular durante EMT puede ser investigada por silenciar o ectópica que expresa la isoforma específica y el seguimiento de la inducción de EMT en el sistema de EMT-inducible descrito 11.

La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un programa de desarrollo que impulsa la morfogénesis de órganos y la remodelación de tejidos durante la embriogénesis. Cuando se activa de forma anormal, EMT promueve la metástasis tumoral y la fibrosis de órganos 1,2. Estudios convincentes han descrito la importancia de la regulación transcripcional durante el proceso de la EMT, que se define por varios factores de transcripción, como Twist, Caracol, y ZEB, que reprimen la expresión de la proteína de unión adherens E-cadherina, lo que resulta en la pérdida de un cobble- piedra, como la morfología del epitelio y la ganancia de un fenotipo mesenquimal fusiforme 3-8. Estudios recientes a través del análisis de todo el genoma de ARN revelaron que existe un grupo de genes cuyos patrones de empalme están asociados ya sea con fenotipos epiteliales o mesenquimales 9,10. El trabajo de nuestro laboratorio funcionalmente conectado splicing alternativo y EMT. Mediante el estudio de la superficie celular molécula de adhesión CD44, hemos demostrado que CD44 alternativa empalme está estrechamente regulada durante EMT, y lo más importante, que la isoforma de empalme CD44 conmutación causalmente contribuye a EMT 11. Splicing alternativo representa un modelo generalizado y conservado de la regulación de genes, ya que hasta el 95% de los genes de varios exones humanos están empalmados alternativamente 12-14. Mediante la generación de múltiples productos de proteína a partir de un único gen, corte y empalme alternativo constituye un mecanismo esencial para la diversidad de proteínas, la adición de otra capa de complejidad al genoma humano. Como tal, la desregulación de splicing alternativo podría dar lugar a profundos efectos biológicos que causan enfermedades humanas. De hecho, el splicing alternativo aberrante en enfermedades se ha documentado desde hace más de una década 15-25, incluyendo los recientes hallazgos de que las mutaciones en los genes que codifican la maquinaria spliceosome se encuentran comúnmente en los síndromes mielodisplásicos 26-28. Por lo tanto, el desarrollo de métodos fiables para la detección de i empalmados alternativamentesoforms es de gran importancia en el estudio de diversos procesos biológicos incluyendo la EMT. Aquí proporcionamos un protocolo para detectar cambios en el splicing alternativo utilizando un modelo EMT inducible. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la detección de isoformas de empalme son adecuados no sólo para el estudio de corte y empalme alternativo durante la EMT, sino también para el estudio de splicing alternativo en otros procesos biológicos. La investigación de corte y empalme alternativo durante EMT es imperativo con el fin de comprender mejor los mecanismos de la EMT y la metástasis del tumor, facilitando así el desarrollo de estrategias eficaces para tratar la metástasis del cáncer.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 &amp;#956;M. Keep the solution at -20 &amp;#176;C protected from light.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>CD44 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>E-cadherin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Catenin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Occludin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000 dilution</td></tr><tr><td>N-cadherin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>GAPDH antibody</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blotting detection reagent</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Chemiluminescence system</td></tr></tbody></table>

detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para detectar splicing alternativo durante la EMT. Los resultados representativos de empalme isoforma CD44 conmutación durante EMT inducida Twist-A continuación se dan como ejemplo. EMT inducida Twist-en las células HMLE / Twist-ER se caracteriza por una transición de un adoquín como fenotipo epitelial a un fenotipo fibroblástico alargada (Figura 2A), la ausencia de marcadores epiteliales E-cadherina, γ-catenina y ocludina y la la regulación positiva de los marcadores mesenquimales fibronectina, N-cadherina, y vimentina (Figura 2B). Además, EMT se evaluó por la pérdida de la localización de la E-cadherina en las uniones célula-célula (Figura 2C). La expresión de CD44 conmutada isoformas de empalme durante la EMT fue examinado por QRT-PCR e inmunotransferencia. El gen CD44 humano está compuesto de nueve exones variables. El empalme alternativo de CD44 permite a las células proDuce variantes de CD44 (CD44v) que incluyen al menos un exón variable y CD44 estándar (CD44s) que carece de todos los exones variables. Figura 3A representa la estrategia de diseño del cebador para la detección de diversas isoformas de empalme CD44. Para la detección de los productos CD44s-exón omitido, el cebador directo se encuentra en el exón 5 constitutiva, mientras que el cebador inverso extiende a través de la unión entre los exones constitutivos 5 y 6 Para la detección de isoformas de empalme CD44v que contiene la variable V5 y V6 exones, el delantero y atrás primers están diseñados dentro de la v5 y v6, respectivamente. Los cebadores para la detección de variables de otras isoformas que contienen el exón-CD44 pueden ser diseñados utilizando la misma estrategia. Además, se detecta transcripción total de CD44 utilizando adelante y cebadores localizados en el exón constitutiva 2 y el exón 3, respectivamente (Figura 3A) revertir. Como se muestra en la Figura 3B, QRT-PCR análisis de la utilización de estos conjuntos de cebadores indica una disminución significativa en CDARNm 44v y el aumento de CD44s mRNA después de 14 días de tratamiento TAM en las células HMLE Twist-ER-expresión. Por el contrario, la transcripción total de CD44 se mantuvo sin cambios durante EMT (Figura 3C). Consistente con los resultados de QRT-PCR, el nivel de proteína de CD44v disminuyó notablemente, mientras que la expresión de la proteína CD44s se upregulated en gran medida (Figura 3D). Por lo tanto, la principal isoforma de CD44 se desplazó de CD44v a CD44s durante el proceso de EMT. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig1highres.jpg" width="600" /> Diseño de la figura 1 Primer. Diagramas esquemáticos que ilustran la ubicación de cebadores para la detección de isoformas de empalme en un modelo de omisión de exón. Las cajas grises representan los exones constitutivos, las cajas de naranjas representan exones variables, y las delgadas líneas que conectan cuadros denotan intrones. Las ubicaciones de cebadores son indicated por flechas: flechas negras indican los conjuntos de cebadores para la detección de mRNA total flechas de color naranja indican conjuntos de cebadores para amplificar isoformas exón-incluido, y las flechas azules indican los conjuntos de cebadores para la detección de isoformas de omisión de exón. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. inducción de la EMT. (A) Imágenes de contraste de fase (10X) que ilustra los cambios morfológicos en las células HMLE / Torsión-ER antes (sin tratar) y después de 14 días de tratamiento TAM. (B) El análisis por inmunotransferencia de los marcadores de EMT en células HMLE / Torsión-ER antes (sin tratar) y después de 14 días de tratamiento TAM. Tras el tratamiento de TAM, marcadores epiteliales E-cadherina, γ-catenina, y ocludina fueron downregulated, y mesenquimales marcadores fibronectina, N-cadherina y vimentina se upregulated. (C) imágenes de fluorescencia Inmune (63X) que indica la pérdida de E-cadherinalocalización en las uniones entre células después de 14 días de tratamiento TAM. Tinción verde indica E-cadherina, y DAPI (azul) indica núcleos. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Interruptor de isoformas de empalme CD44 durante la EMT. (A) Diseño de cebadores para la detección de isoformas de empalme CD44. Las cajas grises representan los exones constitutivos, las cajas de naranjas representan exones variables, y las delgadas líneas que conectan cuadros denotan intrones. Las ubicaciones de imprimación se indican con flechas: flechas negras indican los conjuntos de cebadores para la detección de mRNA total de CD44, flechas de color naranja indican conjuntos de cebadores para amplificar CD44v5-6, y las flechas azules indican los conjuntos de cebadores parala detección de CD44s. (B, C) ​​QRT-PCR análisis de los niveles de isoformas de CD44 durante EMT utilizando cebadores que detectan específicamente CD44v que contiene exones variable V5 y V6 (v5 / 6) y CD44s (B), y total de ARNm de CD44 (C) . Niveles relativos de expresión de mRNA en el Día 14 células se normalizaron a día correspondiente 0 células en TAM grupos tratados y no tratados. Las barras de error indican SEM; n = 3 (D) El análisis por inmunotransferencia de las isoformas de CD44 durante la EMT inducida por TAM en células HMLE / desenroscables ER. Los niveles de E-cadherina y N-cadherina se monitorizaron para identificar el estado de la EMT.

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Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K vistas.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

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Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genética

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Biología del Desarrollo

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides constitutive splicing, alternative mRNA splicing allows the expression of multifunctional proteins from one gene. As interactome studies are generally the first analysis for new or unknown proteins, the association of the bait protein with splicing factors is an indication that it can participate in mRNA splicing process, but to determine in what context or what genes are regulated is an empirical process. A good starting point to evaluate this function is using the classical minigene tool. Here we present the adenoviral E1A minigene usage for evaluating the alternative splicing changes after different cellular stress stimuli. We evaluated the splicing of E1A minigene in HEK293 stably overexpressing Nek4 protein after different stressing treatments. The protocol includes E1A minigene transfection, cell treatment, RNA extraction and cDNA synthesis, followed by PCR and gel analysis and quantification of the E1A spliced variants. The use of this simple and well-established method combined with specific treatments is a reliable starting point to shed light on cellular processes or what genes can be regulated by mRNA splicing.

This protocol presents a rapid and useful tool for evaluating the role of a protein with uncharacterized function in alternative splicing regulation after chemotherapeutic treatment.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Bioquímica

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biología

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

RNA Splicing

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called the primary transcript. The primary transcripts that become mRNAs are called precursor messenger RNAs (pre-mRNAs). Eukaryotic pre-mRNA contains alternating sequences of exons and introns. Exons are nucleotide sequences that code for proteins, whereas introns are the non-coding regions. In RNA splicing, introns are removed and exons are bonded together.
Splicing is Mediated by the Spliceosome
Splicing occurs in the nucleosome and is mediated by a complex of proteins and small RNAs called small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). snRNPs, together with other proteins, form the spliceosome, which recognizes specific nucleotide sequences at the ends of the exon and intron. First, it binds to a GU-containing sequence at the 5&#39; end of the intron and to a branch point sequence containing an A towards the 3&#39; end of the intron. In a number of carefully-orchestrated steps, other snRNPs then bring the branch point close to the 5&#39; splice site. Subsequently, a chemical reaction cleaves the 5&#39; end of the intron from its upstream exon and attaches it to the branch point, forming a loop called a lariat. To release the lariat, the AG-containing sequence of the intron near the 5&#39; end of the downstream exon reacts with the 3&#39; end of the upstream exon. This reaction patches the two exons together, concluding the splicing process.
Splicing Allows the Expression of Several Proteins from a Single Gene
Typically, exons are joined together in the order in which they appear in a gene. However, during alternative splicing, different combinations of exons in pre-mRNA are combined to form mature mRNA. This produces several different proteins from a single pre-mRNA transcript.
Different patterns of alternative splicing include exon skipping, alternative 5&#39; or 3&#39; splice sites, and intron retention. These patterns are guided by the length of exons or introns and the strength of the splicing signal at the splice sites. Because of this, exons that are shorter than other exons may be overlooked by the spliceosome and omitted from the mature mRNA. In contrast, introns that are significantly shorter than other introns may evade removal by the spliceosome and are retained in the mature mRNA. As a result, alternative splicing generates variants of mature mRNA that were copied from the same stretch of DNA. The RNA sequence variants produce different proteins with additional or fewer amino acids, shifts in the reading frame, or a premature stop codon. These protein isoforms have different biological properties, including function, cellular localization, and interaction with other proteins, thereby playing a vital role in tissue- and environment-specific gene expression.
Abnormal Splicing Can Cause Diseases
Errors in splicing can produce aberrant protein isoforms, which may contribute to diseases, including cancer. For instance, alternative splicing of the BCL2L1 gene generates a long and short protein isoform&#8212;BCL-XL and BCL-XS, respectively&#8212; through the use of alternative 5&#39; splice sites. The longer BCL-XL isoform promotes cell survival and is highly expressed in several types of cancers (e.g., blood, breast, and liver cancers). Expression of the short BCL-XS isoform that promotes cell death is suppressed in cancer.

RNA Splicing, Lariat and the Spliceososme

El empalme de ARN

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called ...