Este trabajo fue apoyado por becas de Nacional de Salud y el Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC) (526.615 y 545.906) y en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS. DS es un compañero de NHMRC.

1. Preparación de [3 H]-colesterol <ol><li> En la campana de humos, dispensar la cantidad necesaria de colesterol [3 H] en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (0,5 Ci (19 kBq) por pocillo se requiere para un ensayo típico). </li><li> Si [3 H]-colesterol se suspendió en tolueno, que se seque por completo con gas N2 y resuspender con 100% de etanol a una concentración final de 1 Ci (37 kBq / l. Vortex y se mezcla bien. </li></ol> 2. Células en placas y al etiquetado de colesterol celular Este protocolo ha sido probado con los siguientes tipos de células: monocitos humanos 4,5, THP-1 monocitos humanos macrófagos 6,7,8, RAW 264,7 macrófagos murinos 5,9,10,11, células HeLa 12, endoteliales de vena umbilical humana las células (HUVEC), las células BHK-21 9, fibroblastos humanos y de ratón, las células HepG2 13,14 hepatocarcinoma humano 15 y, en forma modificada, a partir de plaquetas &lt;sup&gt; 16. <ol><li> Resuspender las células y contar con ellos. Células de la placa en placas de 12 pocillos en la densidad final de 0.2x10 6 células por pocillo en 0,9 ml de medio completo. Las células seguirá creciendo y llegará a 0.8x10 6 células por pocillo en el momento del experimento de flujo de salida. Para las células que no se dividen, como diferenciadas células THP-1, la densidad de siembra debe ser 0.8x10 6 células por pocillo. Si se utiliza 6 - o placas de 24 pocillos, doble o la mitad del número de células por pocillo, respectivamente. El número de pozos debe ser suficiente para las determinaciones cuadruplicadas para cada condición experimental. </li><li> Si la diferenciación de células THP-1 se requiere, añadir PMA (concentración final 0,1 mg / ml) a los medios para 48-72 h. </li><li> Añadir una pequeña alícuota de los medios en el tubo de microcentrífuga que contiene la [3 H] colesterol. </li><li> Lave lados del tubo con los medios de comunicación antes de añadir [3H]-colesterol en una alícuota separada de medios completos (100 l / pocillo). </li> &lt;li&gt; Añadir los medios de comunicación que contienen [3 H] colesterol a los pozos con las células (volumen final por pocillo es de 1 ml). Si ningún tratamiento de las células se requiere antes de etiquetado, las células pueden ser cultivadas en [3 H] colesterol que contienen medio. </li><li> Se incuban las células durante 48 horas en cultivo celular incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol> 3. Equilibrio de incubación <ol><li> Después de la incubación de 48 horas, compruebe las células bajo el microscopio. Asegúrese de que estén sanos y se encuentran en aproximadamente el 80% de confluencia. </li><li> Retire los medios de comunicación que contiene [3 H] colesterol. Lave suavemente las células con PBS. Repita 3 veces el lavado. </li><li> Preparar medios libres de suero. Si es necesario, activar las células mediante la adición de agonistas de LXR (como A-901317 en 1.4 mmol / L) o cAMP (0,3 mmol / L; para las células de origen ratón) con el suero libre de los medios. </li><li> Añadir 500 l medios de comunicación libres de suero a cada pocillo. </li><li> Incubar durante 18 horas en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Incubación eflujo de colesterol <ol><li> Después de la incubación de 18 horas en medio libre de suero, comprobar las células bajo el microscopio. Asegúrese de que estén sanos y confluente (mínimo 80% de confluencia). </li><li> Preparar una solución de flujo de salida de colesterol aceptantes en medio libre de suero. Ejemplos de aceptadores incluyen: La apolipoproteína AI (ApoA-I) (concentración final de 10 mg / ml) Lipoproteína de alta densidad (HDL) (concentración final 20 ug / ml) Ciclodextrina (concentración final 200 mg / ml) Plasma (concentración final de 1-2%) </li><li> Lave suavemente las células con PBS. </li><li> Añadir 250 l de medio libre de suero con aceptores a cada pocillo. </li><li> Deja una serie de pozos para determinar el fondo de eflujo (flujo de salida de medio libre de suero con el NO aceptante) </li><li> Se incuban las células durante 2 horas en cultivo celular incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). Duración de la incubación de eflujo puede variar desde 30 minutos a 8 horas si es necesario. </li></ol> 5. Procesamiento de Samples <ol><li> Después de 2 horas de incubación revisar las células bajo el microscopio. </li><li> Recoger los medios de comunicación en tubos de 1,5 ml de microfuga. Girar a 14.000 rpm durante 1-10 min a temperatura ambiente para eliminar los desechos celulares. </li><li> Transferir 100 l medios en 7 ml de vial de centelleo. Añadir 5 ml de Plus Insta-gel (PerkinElmer) y la mezcla de vórtice. Almacenar las muestras restantes a 4 ° C. </li><li> Colocar las placas en el congelador durante 30 minutos. Añadir 500 l DH 2 O a cada pocillo. Ver células bajo el microscopio para asegurar que todas las células han levantado desde el fondo de los pozos. Si todavía adheridas, o bien deje los platos con dH 2 O a 4 ° C durante la noche pozos o rasguño. </li><li> Una vez que todas las células ya han despegado, pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper agregados celulares. Transferir 100 l en 7 ml viales de centelleo. Añadir 5 ml de Plus Insta-gel (PerkinElmer) y la mezcla de vórtice. Guarde el resto de las placas a 4 ° C. </li><li> Coloque viales de centelleo en un contador de centelleo. Configurar el contador para contar a [3H] endpm unidades. </li></ol> 6. El análisis de los resultados <ol><li> La tasa de eflujo de colesterol se expresa generalmente como una proporción de colesterol a partir de células movido al aceptor. La siguiente fórmula se utiliza: </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li> El flujo de salida específica se calcula como la diferencia entre el flujo de salida en la presencia o ausencia del aceptor (blanco). </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. Línea de tiempo <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. Los resultados representativos Un ejemplo de un resultado de un experimento eflujo de colesterol se muestra en la fig. 1. En este experimento, THP-1 monocitos humanos se diferencian en macrófagos y el eflujo de colesterol a receptores diferentes eraprobado. Eflujo de colesterol y medio sin aceptantes (&quot;en blanco&quot;) fue de 0,79% y este valor fue considerado como un flujo de salida no son específicos y se restará de los demás valores. Eflujo de colesterol para la salud humana apoA-I (concentración final de 30 mg / ml) fue de 4,75%. Una muestra de plasma de referencia se incluyó en este experimento para controlar la variabilidad inter-experimental. Una muestra de referencia se puede utilizar para la normalización de datos a través de un gran número de experimentos, pero hemos encontrado prudente repetir el ensayo si la variabilidad es alta. Un plasma del paciente (concentración final 2%) se puso a prueba antes y después de que el paciente fue tratado con medicamentos. Se concluyó que en este medicamento paciente tenía un impacto negativo en la capacidad de plasma para apoyar el eflujo de colesterol. Otro ejemplo de un resultado del experimento eflujo se muestra en la fig. 2. En este experimento RAW 264.7 macrófagos fueron activados o no activados por incubación durante la noche con agonista LXR A-901317 (concentración final1 mol / L) y el eflujo de colesterol a la misma muestra de plasma humano (2%) se ensayó. Se concluyó que la activación de la expresión celular de los transportadores ABC con agonista LXR aumenta la capacidad de las células para liberar el colesterol a aceptor extracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> Figura 1. Eflujo de colesterol de células THP-1 a aceptores diversos. Porcentaje de eflujo de colesterol (es decir, la proporción de colesterol marcado movido a partir de células al aceptor especificado) se muestra después de la sustracción de los valores en blanco. La media ± desviación estándar de las determinaciones de cuatro ejemplares, * p &lt;0,05. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> Figura 2. Eflujo de colesterol de RAW 264.7 activado o no activado con agonista LXR al plasma humano. Porcentaje de eflujo de colesterol (es decir, la proporción de colesterol marcada movido de células para elaceptor se especifica) se muestra después de la sustracción de los valores en blanco. La media ± desviación estándar de las determinaciones de cuatro ejemplares, * p &lt;0,001.

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relacionados con este estudio.

El método descrito para medir el eflujo de colesterol está diseñado para medir el movimiento de colesterol de las células a un aceptor de colesterol extracelular. Hay varias consideraciones importantes en la comprensión de esta metodología. Etiquetado y el equilibrio En la metodología descrita colesterol marcado se añadieron al suero que contiene suero. Aunque nunca investigado en detalle, se supone que el colesterol se incorpora en las lipoproteínas de suero y que son absorbidos por las células. Es importante dejar tiempo suficiente para que las lipoproteínas que deben abordarse y para el colesterol para pasar de las lipoproteínas de las membranas celulares. Por lo general, el etiquetado 24 horas es suficiente, pero el etiquetado durante 48 horas logra una mayor actividad específica de colesterol intracelular. Hay que tener en cuenta que si [14 C] el colesterol se utiliza en lugar del colesterol [3 H] (por ejemplo, en los experimentos de doble etiquetado), el acto específicovidad de la primera es muy baja y la adición de colesterol lo suficiente marcado para lograr una actividad destinada específica puede cambiar el contenido de la celda de colesterol y por lo tanto influir en el resultado. También es importante que (i) no hay colesterol marcado o lipoproteínas no específicamente atrapados en la superficie celular como este colesterol será rápidamente incorporada por un aceptor no específico a través de transferencia, y (ii) el colesterol marcado se equilibra entre los diversos intracelular piscinas. Aunque en nuestra experiencia de incubación de 24 h en el equilibrio medio libre de suero es suficiente para lograr estos objetivos, por lo general 48 h de incubación se utiliza. Muchos tipos de células no sobreviven durante 48 horas o incluso 24 h en medio libre de suero. En este caso 0,1% de BSA (esencialmente libre de ácidos grasos) puede actuar como sustituto. Lipoproteína-empobrecido suero o varios suplementos de reemplazo de suero se puede utilizar como un último recurso, pero es importante reconocer que el suero lipoproteína-deficiente hace y suplementos de suero de recambio puede contain apolipoproteínas y que pueden afectar el resultado. Lamentablemente, los fabricantes no suelen revelar la composición de los suplementos. Duración de la incubación eflujo Eflujo de colesterol conduce a la carga de colesterol a un aceptor extracelular y el agotamiento de colesterol en las células. Los cambios en el contenido de colesterol de ambas células y aceptor pueden afectar la tasa y otras propiedades de eflujo de colesterol. Además, si el aceptor contiene colesterol (por ejemplo HDL) puede pasar de aceptor a las células y si la actividad específica de colesterol en el aceptor llega a ser significativo, que complican la interpretación de los resultados. Por lo tanto, lo mejor es mantener incubación eflujo tan corto como sea posible, permitiendo sin embargo el tiempo para una cantidad suficiente de colesterol marcado para mover a partir de células para el aceptor para permitir una detección fiable. Generalmente 2-6 horas es el tiempo recomendado. Las incubaciones de más de 24 horas que reflejan un estado de equilibrium y por lo tanto, será indicativa de la capacidad de aceptor de acumular colesterol en lugar de la tasa de eflujo de colesterol. Aceptador Aceptantes diferentes son específicos para las diferentes vías de salida del colesterol. Para la medición de flujo de colesterol específico, apoA-I se utiliza para reflejar ABCA1 dependiente de HDL, mientras que de salida o HDL reconstituido para ABCG1 y las vías de SR-B1-dependientes. Ciclodextrina se utiliza a menudo para evaluar no específica flujo de salida. Es importante incluir en el experimento un &quot;blanco&quot; de la muestra, que no contiene aceptor en absoluto, para medir la contribución de la no-específica disociación de colesterol y colesterol liberado de las células muertas de desintegración. La concentración del aceptor Eflujo de colesterol incluye (i) la liberación de colesterol por las células y (ii) su absorción por un aceptor, ambos pasos puede ser limitante de la velocidad. Si el objetivo experimental es investigar los cambios en elcapacidad de las células para liberar el colesterol (por ejemplo después de la transfección o derribo-), entonces la concentración del aceptor no debe ser limitante de la velocidad. Para apoA-I y HDL las concentraciones de 30-50 g / ml son generalmente no limitante de la velocidad. Si la capacidad del aceptor para apoyar el eflujo de colesterol es el objetivo de investigación (por ejemplo, capacidad de HDL aislada o muestras de plasma de pacientes o animales para apoyar el eflujo de colesterol), entonces la concentración del aceptor debe ser limitante de la velocidad. Para apoA-I y HDL esto suele 10 ug / ml, para muestras de plasma esto es generalmente 1-2%, pero una dependencia de la dosis preliminar experimento para encontrar una concentración correcta es esencial para elegir la dosis. La activación de las células Los principales elementos responsables de la salida del colesterol específico son dos transportadores ABC, ABCA1 y ABCG1. Ambos están regulados por LXR y de pre-incubación de las células con agonistas de LXR (compuesto más popular es-901.317 disponibles de SIGMA) que se utiliza en concentraciones 1-4 mol / L aumenta significativamente la proporción de eflujo de colesterol específico. Las células de origen de ratón, tales como RAW 264.7 o J774, también puede ser activada por el AMPc (0,3 mmol / l). La carga de las células con colesterol La carga de las células con el colesterol por la pre-incubación de las mismas con el complejo oxidado acetilado o LDL o colesterol-ciclodextrina también estimula el eflujo de colesterol. Hay que tener en cuenta que la carga de las células, especialmente macrófagos con los cambios de colesterol muchos aspectos de su metabolismo. Elección del modelo (el colesterol cargado contra el colesterol no se carga) depende de objetivo científico del estudio. Presentación de los resultados Por lo general, los resultados del experimento de eflujo de colesterol se presentan como un porcentaje de colesterol liberado de las células: esto elimina la variabilidad del número de células en pocillos individuales y en la eficiencia de etiquetado. Sin embargo, thes sólo es válida si el tratamiento no afectó la absorción de colesterol y la expulsión de la de la ausencia del aceptor (en blanco). Estas dos condiciones tienen que ser comprobado a nivel experimental. Teóricamente, este método puede ser utilizado para estudiar flujo de salida de cualquier circunscripción celular a un aceptor extracelular. Si, a diferencia de colesterol, tal compuesto se metaboliza, entonces una etapa de purificación analítica necesita ser incluido. Además, si el compuesto se sintetizó en la célula, precursores sintéticos pueden ser utilizados para el etiquetado. Por ejemplo, [14 C] acetato y [3H]-el agua se utiliza para estudiar el flujo de salida de colesterol de nueva síntesis y [14 C] colato para estudiar el flujo de salida de los fosfolípidos. En este caso el colesterol recién sintetizado necesita ser separado a partir de precursores y productos intermedios, por lo general por cromatografía en capa fina.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivos \ células </td><td> HeLa </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> Medios completos </td><td colspan="3"> RPMI - 10% de FCS - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos </td><td> M199 - 5% de FCS - 1% de L-glutamina - Pluma de 1% por estreptococos - HEPES al 2% (1M) - 7% de las células endoteliales suplemento de crecimiento (ECG) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% de FCS - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos </td></tr><tr><td> Medio libre de suero </td><td colspan="3"> RPMI - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos </td><td> M199 - 1% de L-glutamina - Pluma de 1% por estreptococos - HEPES al 2% (1M) - 7% de células endoteliales crecenº suplemento (ECG) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% de L-glutamina - Pen 0,2% por estreptococos </td></tr><tr><td> Paso Método </td><td> 1 x Tripsina </td><td> Suspensión </td><td> Raspar </td><td colspan="3"> 1 x Tripsina </td></tr><tr><td> Paso Relación </td><td> 03:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 01:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> Activación de las células (opcional) </td><td></td><td colspan="5"> A-901317 - LXR-agonista - Concentrado final. 4 micras, </td></tr><tr><td> Otros reactivos </td><td></td><td> forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) - Diferenciación celular - Concentrado final. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

El contenido de colesterol de las células deben mantenerse dentro de los límites muy estrechos, demasiado o demasiado poco de colesterol en unos resultados de células en la interrupción de las membranas celulares, la apoptosis y necrosis 1. Las células pueden colesterol fuente de la síntesis intracelular y de las lipoproteínas del plasma, ambas fuentes son suficientes para satisfacer plenamente las necesidades de células para el colesterol. Los procesos de la síntesis de colesterol y el consumo están fuertemente regulados y las deficiencias de colesterol son poco frecuentes 2. El exceso de colesterol es de 3 problema más común. Con la excepción de los hepatocitos y algunas células adrenocorticales grado, las células son incapaces de degradar el colesterol. Las células tienen dos opciones para reducir su contenido de colesterol: para convertir el colesterol en ésteres de colesterol, una opción con una capacidad limitada, como la sobrecarga de las células con ésteres de colesterol también es tóxico, y el eflujo de colesterol, una opción con la capacidad potencialmente ilimitada. Eflujo de colesterol es una especificaciónproceso de IFIC que está regulada por una serie de transportadores intracelulares, como el ATP vinculante cassette transportista proteínas A1 (ABCA1) y G1 (ABCG1) y B1 del receptor scavenger tipo. El aceptador natural de colesterol en plasma es de lipoproteína de alta densidad (HDL) y apolipoproteína AI. El ensayo de eflujo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas. Se mide la capacidad de las células para mantener el eflujo de colesterol y / o la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en los pasos siguientes. Paso 1: etiquetado colesterol celular mediante la adición de colesterol marcado a medio que contenía suero e incubando con células durante 24-48 h. Este paso puede ser combinado con la carga de las células con el colesterol. Paso 2: incubación de las células en medio libre de suero que se equilibre el colesterol marcado entre todos los grupos de colesterol intracelular. Esta etapa puede ser combinado con la activación de celular CHtransportistas olesterol. Paso 3: incubación de las células con aceptor extracelular y cuantificación de movimiento de colesterol marcado de las células al aceptor. Si los precursores de colesterol se utiliza para etiquetar el colesterol recién sintetizado, un cuarto paso, la purificación de colesterol, puede ser requerido. El ensayo proporciona la siguiente información: (i) cómo un tratamiento particular (una mutación, un derribo, la sobreexpresión de una o de un tratamiento) afecta a la capacidad de las células con el colesterol flujo de salida y (ii) cómo la capacidad de los aceptantes de plasma para aceptar el colesterol se ve afectada por una enfermedad o un tratamiento. Este método se utiliza a menudo en el contexto de la investigación cardiovascular, enfermedades metabólicas y neurodegenerativas, infecciosas y enfermedades reproductivas.

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Ensayo de salida de colesterol | Medicina | Video

Cholesterol Efflux Assay

El ensayo de colesterol está diseñado para cuantificar la tasa de eflujo de colesterol a partir de células cultivadas y la capacidad de plasma aceptores para aceptar el colesterol liberado de las células. El ensayo consiste en el etiquetado de las células con el colesterol, equilibración de colesterol entre piscinas intracelulares y la liberación de colesterol a un aceptor extracelular.

Ensayo de eflujo de colesterol

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Investigación

Química

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Bioquímica

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Inmunología e Infección

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the outer leaflet drives the membrane&#39;s propensity to form lipid rafts. The transient nature of lipid rafts makes it difficult to study in living cells. Therefore, methods that add or remove raft-forming lipids at&#160;the outer leaflet of living cells facilitate studying the characteristics of rafts, such as their effects on membrane proteins. Lipid exchange experiments developed in our lab utilize lipid-loaded cyclodextrins to remove and add exogenous phospholipids to change the lipid constitution of the plasma membrane. Substituting the membrane with a raft or non-raft-forming lipid can aid in studying the effects on transmembrane protein activity. Here, we describe a method for lipid exchange on the outer leaflet of the plasma membrane using lipid-loaded cyclodextrin. We demonstrate the preparation of the exchange media and the subsequent treatment of attached mammalian cells. We also showcase how to measure the efficiency of exchange using HP-TLC. This protocol yields a nearly complete replacement of the outer leaflet with exogenous lipids without altering cellular viability, permitting further experimentation on modified intact plasma membranes.

We describe a method for using cyclodextrin to mediate exchange between lipids of the plasma membrane with exogenous lipids. This technique can be paired with experiments studying transmembrane proteins, which behave differently in lipid raft-like environments than they do in non-raft-like environments.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Medicina

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Ensayo de eflujo de colesterol marcado con Nitrobenzoxadiazole de alto rendimiento

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canales y Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Biología

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...