Activación cardíaca retrospectiva con un prototipo de tomógrafo computarizado de rayos X para animales pequeños

Proporcionamos una descripción completa del método de activación cardíaca retrospectiva intrínseca del CrumpCAT, un prototipo de escáner de tomografía computarizada (TC) de rayos X para animales pequeños diseñado y construido en nuestra institución de investigación.

El CrumpCAT es un prototipo de escáner de tomografía computarizada (TC) de rayos X para animales pequeños desarrollado en nuestra institución de investigación. El detector CMOS con una velocidad de fotogramas máxima de 29 Hz y fuentes similares de rayos X de tungsteno con energías que oscilan entre 50 kVp y 80 kVp se utilizan ampliamente en los instrumentos de TC de rayos X preclínicos disponibles en el mercado. Esto hace que el trabajo descrito sea muy relevante para otras instituciones, a pesar de la opinión generalizada de que estos detectores no son adecuados para controlar las altas frecuencias cardíacas de los ratones (~600 latidos/min). El escáner cuenta con imágenes de resolución media (200 μm) y alta (125 μm), fluoroscopia, activación respiratoria retrospectiva y activación cardíaca retrospectiva, con reconstrucción de imágenes de proyección iterativa o filtrada. Entre estas características, la compuerta cardíaca es la característica más útil para estudiar las funciones cardíacas in vivo, ya que elimina eficazmente la borrosidad de la imagen causada por el movimiento respiratorio y cardíaco.

Aquí, describimos nuestro método para la tomografía computarizada cardíaca retrospectiva preclínica, destinada a avanzar en la investigación sobre la función y el análisis de la estructura cardíaca in vivo . El método de activación cardíaca adquiere un gran número de proyecciones en el menor tiempo de exposición práctico (~20 ms) y luego extrae retrospectivamente las señales respiratorias y cardíacas de los cambios temporales en secuencias de proyección brutas. Estas señales se utilizan para rechazar las proyecciones que pertenecen a la fase de inspiración de alta velocidad de movimiento del ciclo respiratorio y para dividir las proyecciones restantes en 12 grupos, cada uno correspondiente a una fase del ciclo cardíaco. Cada grupo se reconstruye de forma independiente utilizando un método iterativo para producir una imagen volumétrica para cada fase cardíaca, lo que da como resultado un conjunto de datos de cuatro dimensiones (4D).

Estas imágenes de fase se pueden analizar de forma colectiva o individual, lo que permite una evaluación detallada de la función cardíaca. Demostramos la efectividad de ambos enfoques de la función de activación cardíaca del prototipo del escáner a través de resultados representativos de imágenes in vivo .

La investigación con animales pequeños a menudo emplea una combinación de modalidades de imagen no invasivas, siendo la tomografía computarizada (TC) de rayos X, una opción destacada debido a su madurez, rentabilidad, velocidad ^1,2 y capacidad para proporcionar información complementaria junto con otras modalidades como la tomografía por emisión de positrones (PET)^2,3 y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT)^2,4. Sin embargo, al igual que otras técnicas de imagen, la TC es susceptible a los artefactos de movimiento fisiológico causados por el latido del corazón o la respiración, que introducen desenfoque y limitan la precisión de la investigación.

Para abordar esta limitación, el desenfoque del movimiento respiratorio y cardíaco se puede mitigar a través de una técnica conocida como compuerta 5,6,7,8, donde la adquisición de datos se sincroniza con fases específicas del ciclo cardíaco o respiratorio (o puertas). Un enfoque para lograr esto, conocido como compuerta prospectiva ^3,6, consiste en conectar sensores al animal para proporcionar señales de compuerta en tiempo real a un escáner compatible. Si bien es efectivo, este método requiere mucho trabajo y tiempo, especialmente cuando se colocan sensores en el pecho y las patas de animales pequeños como ratones, lo que limita la escala de los estudios. Alternativamente, la activación retrospectiva intrínseca 7,9,10,11 implica la adquisición de datos de series temporales sin el uso de sensores, sino mediante la identificación de características en los datos que permiten la clasificación retrospectiva de los resultados en función de su fase en el ciclo cardíaco o respiratorio. Este enfoque ofrece resultados comparables a los de las compuertas prospectivas, pero sin la necesidad de hardware adicional ni el esfuerzo que implica la conexión del sensor de pulso y, por lo tanto, simplifica enormemente los protocolos experimentales.

En nuestro método para la toma de imágenes preclínicas de TC cardíaca, utilizamos la activación retrospectiva intrínseca para extraer los ciclos respiratorios y cardíacos de las variaciones de amplitud en las regiones de las proyecciones de rayos X que exhiben los cambios más significativos entre fotogramas sucesivos. Para facilitar este proceso, se co-registra una plantilla de tórax de ratón en la primera proyección posteroanterior utilizando Información Mutua¹². Una vez que la plantilla está en su lugar, las intensidades de píxeles en una ventana cerca del diafragma se suman para generar una señal respiratoria sustituta, mientras que las que están cerca del miocardio se suman para derivar la señal cardíaca sustituta. A continuación, estas señales se filtran de paso de banda en el dominio del tiempo, y a cada fotograma del conjunto de datos se le asigna un número de fase fraccionaria (entre 0 y 1) en función de su fase respiratoria y cardíaca. Esto permite la selección o el rechazo de proyecciones de acuerdo con sus valores de fase. Normalmente, se conservan los fotogramas correspondientes a la fase de fin de espiración del ciclo respiratorio (0,15 ≤ fase < 0,85), mientras que los de la fase de inspiración, donde el movimiento es más pronunciado, se descartan. Los fotogramas restantes se agrupan en 12 fases cardíacas, cada una de las cuales representa 1/12 (0,083) del ciclo cardíaco y se reconstruyen en imágenes 3D utilizando un método iterativo (Ordered Subset Expectation Maximization [OSEM]^)13,14. Todo el proceso se resume en la Figura 1.

Los protocolos experimentales con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). En este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6J (8 semanas de edad, machos, 24-26 g). El tomógrafo utilizado en este estudio es el CrumpCAT (Figura 2), un prototipo desarrollado en nuestra institución de investigación para la investigación preclínica, que nos proporciona el control y la flexibilidad necesarios para optimizar los protocolos de adquisición y reconstrucción. El método supone que los ratones anestesiados tendrán una frecuencia cardíaca no superior a 600 latidos/min y una frecuencia respiratoria entre 20 y 180 respiraciones/min¹⁵.

1. Configuración del equipo

1. Opere la fuente de rayos X a un voltaje máximo de 50 kVp con corriente continua de 200 μA.
2. Establezca el agrupamiento de píxeles de la cámara de rayos X en 2 y el tiempo de exposición en su valor práctico más corto (20 ms de tiempo de exposición más 14 ms de tiempo de lectura para un tiempo de muestreo total de 34 ms).
   NOTA: La opción sin discretización (discretización 1) tiene una velocidad de fotogramas más lenta y, por lo tanto, no se puede utilizar para adquisiciones controladas. La velocidad máxima de fotogramas es de unos 30 fotogramas/s.

2. Preparación animal

1. Anestesiar ratones con una mezcla de oxígeno y gas isoflurano a una concentración del 2,0%.
2. Mantenga a los animales bajo anestesia durante 10 minutos antes de la tomografía computarizada, para asegurarse de que los signos vitales estén estables y que los animales estén relajados para evitar cualquier movimiento corporal durante la exploración. Juzgue la profundidad de la anestesia de un ratón por la falta del reflejo de pellizco del dedo del pie al pellizcar firmemente la membrana entre los dedos con una uña.
3. Para que las imágenes con compuerta cardíaca visualicen las cavidades cardíacas, inyecte por vía intravenosa 100 μL de agente de contraste para TC a través de la vena de la cola inmediatamente antes de la imagen para TC (Figura 3A).
4. Coloque el ratón anestesiado dentro de la cámara de imágenes de TC (Figura 3B).

3. Adquisición de datos

1. Encienda el software CrumpCAT.
2. Tomografía computarizada sin compuerta con alta resolución (125 μm, binning 1) (Figura 4A)
   1. Introduzca un ID de estudio en la interfaz de usuario.
   2. Seleccione Mouse Hi-Res en el menú desplegable Protocolo .
   3. Haga clic en el botón Escanear de la interfaz de usuario para adquirir 720 proyecciones con un tiempo de exposición de 80 ms/proyección.
3. TC no compuerta con resolución media (200 μm, binning 2) (Figura 4B)
   1. Introduzca un ID de estudio en la interfaz de usuario.
   2. Seleccione Estándar de mouse en el menú desplegable Protocolo .
   3. Haga clic en el botón Escanear de la interfaz de usuario para adquirir 720 proyecciones con un tiempo de exposición de 100 ms/proyección.
4. Tomografía computarizada con compuerta (200 μm, agrupación 2) (Figura 4C)
   1. Introduzca un ID de estudio en la interfaz de usuario.
   2. Seleccione Cardiac Gating en el menú desplegable Protocolo .
   3. Haga clic en el botón Escanear de la interfaz de usuario y adquiera 21.600 proyecciones con un tiempo de exposición de 20 ms/proyección.

4. Preprocesamiento de datos

NOTA: Los pasos de preprocesamiento solo son necesarios para las adquisiciones controladas. Todos estos pasos se realizan automáticamente mediante el software de reconstrucción y no se requiere la intervención del operador.

1. Extracción de señales
   1. Para el co-registro de la plantilla de tórax, deje que una pequeña imagen (plantilla) que represente de manera tosca un tórax de ratón con las costillas, el corazón, los pulmones y el hígado se registre automáticamente en la primera proyección de rayos X, maximizando la Información Mutua¹² entre la proyección y la plantilla (Figura 5).
      NOTA: Solo se realizan operaciones de conversión en la plantilla y la plantilla de registro conjunto se utiliza para identificar regiones de interés (ROI) en todas las proyecciones.
   2. Para la extracción de señales respiratorias, permita que se designe un ROI rectangular (ROI-1) en la plantilla para representar el diafragma y la señal respiratoria que se generará sumando las intensidades de píxeles dentro de ROI-1 para cada proyección (Figura 5).
   3. Para la extracción de la señal cardíaca, se designe un segundo rectángulo ROI (ROI-2) en la plantilla cerca del corazón, y la señal cardíaca generada sumando las intensidades de píxeles en ROI-2 para cada proyección (Figura 5).
      NOTA: La plantilla de tórax se registra conjuntamente solo en la primera proyección para identificar qué filas y columnas de imagen (ventana) se deben usar para la extracción de señales. Esa ventana es lo suficientemente ancha como para abarcar todas las proyecciones siempre que el animal esté razonablemente centrado, como es el caso cuando se utiliza nuestro lecho^{para animales 16}.
2. Filtro de paso de banda
   1. Permite generar un filtro de paso de banda combinando dos funciones Sinc con diferentes frecuencias de corte en el dominio temporal¹⁷, que corresponden a filtros de paso bajo en el dominio de frecuencia como se describe a continuación.
   2. Deje que el software aplique el filtro de paso de banda en la señal cardíaca utilizando una banda de frecuencia de [300, 600] ^min-1 (Figura 6A).
      NOTA: La señal cardíaca sin filtrar (Figura 6B) todavía contiene una contribución significativa del movimiento respiratorio.
   3. Del mismo modo, permita filtrar la señal respiratoria utilizando una banda de frecuencia de [20, 300] ^min-1. Los armónicos superiores se conservan para producir una señal que no es simplemente sinusoidal e identifica más claramente las dos fases principales: inspiración y espiración.
      NOTA: En este punto, tanto las señales respiratorias como las cardíacas se pueden interpolar fácilmente y considerar funciones continuas de tiempo con el fin de calcular el número de fase fraccional.
3. Asignación de fases
   1. Deje que el software identifique el comienzo de cada ciclo (respiratorio o cardíaco) encontrando los cruces por cero de la primera derivada de la señal. Cada paso por cero corresponde a un máximo en la señal y marca el inicio de un nuevo ciclo y el final del anterior. Para ver un ejemplo, vea la señal respiratoria en la Figura 7.
   2. Permite asignar un valor fraccionario de fase (entre 0 y 1) a cada proyección para cada una de las dos señales (respiratoria o cardíaca).
      NOTA: Por definición, el punto de inicio tiene un valor de fase fraccionaria de cero (para el ciclo actual) o uno (para el ciclo anterior).
4. Máscaras de selección
   1. Permite crear 12 máscaras binarias (una por fase cardíaca) para seleccionar las proyecciones que pertenecen a cada fase. Cada máscara contiene 21.600 entradas (una por proyección) que son 0 o 1, lo que significa rechazar o mantener esa proyección, respectivamente.
   2. Para cada máscara (fase), observe que el software indica si una proyección se mantiene (1) o se descarta (0) de acuerdo con su número de fase fraccionaria. Para la fase 0, se mantienen las proyecciones con un valor de fase cardíaca en el intervalo [0, 1/12]. Para la fase 1, se mantienen los valores de la fase cardíaca en el intervalo [1/12, 2/12], y así sucesivamente.
   3. Para cada mascarilla (fase), tenga en cuenta que cualquier proyección con una fase respiratoria inferior a 0,15 o superior a 0,85 se rechaza (0 en la mascarilla) porque pertenece a la fase de inspiración, que tiene el mayor movimiento (Figura 8A). La figura 8B muestra la asignación de la fase cardíaca a las proyecciones durante los primeros 2 s.
      NOTA: No se introdujo ningún sesgo significativo en este proceso de selección, ya que el número de proyecciones por fase se mantuvo relativamente constante en 1.800 ± 194.

5. Reconstrucción de la imagen

1. En el caso de las tomografías computarizadas sin compuertas, reconstruya las imágenes con una resolución media (200 μm) o alta (125 μm) mediante el algoritmo de retroproyección filtrada (Feldkamp¹⁸) con un filtro Shepp-Logan.
2. En el caso de las tomografías computarizadas con activación cardíaca, se reconstruya cada imagen de fase cardíaca utilizando el algoritmo OSEM^{iterativo 13}, con 12 subconjuntos y 8 iteraciones, teniendo en cuenta solo las proyecciones seleccionadas que contribuyen a una fase determinada (como se indica en una máscara binaria de selección de fase).
3. Para reducir el ruido, aplique un filtro mediano posterior a la reconstrucción en la dimensión temporal (es decir, a través de imágenes) y un filtro gaussiano 3D ligero en la dimensión espacial (σ = 38 μm).
   NOTA: Para la reconstrucción de imágenes con compuerta respiratoria, utilice todas las fases cardíacas indistintamente. La corrección del endurecimiento de la viga (corrección del agua) se aplica a cada reconstrucción.

6. Evaluación por imagen y cuantificación del volumen del ventrículo izquierdo (VI)

1. Abra la imagen de TC en un visor DICOM como Amide¹⁹ (Figura 9A).
2. Mejore el contraste de la imagen visible ajustando el rango del valor CT (medido en la unidad de Hounsfield [HU]) como [-500, 500] (Figura 9A).
3. Evaluación de la calidad de la imagen
   1. Extraiga un ROI para la región calcificada, que se define como la región alrededor del máximo con un valor CT mayor o igual al 85% del valor máximo de HU (Figura 9B).
   2. Utilice la relación contraste-ruido (CNR)^20,21 como métrica para evaluar la calidad de la imagen y su capacidad para identificar estructuras pequeñas, como pequeñas calcificaciones:
      ,
      donde I y σ representan la intensidad media y la desviación estándar de una región: calcificación (subíndice C) o fondo (subíndice B).
4. Cuantificación del volumen del ventrículo izquierdo
   1. Dibuje un ROI a mano alzada en 3D para identificar el VI en cada fase (Figura 10A).
   2. Cuantifique el volumen del VI calculando vóxeles con un valor CT umbral de 730 HU (Figura 10B). En la Figura 10C se muestra un gráfico de los volúmenes de VI.
      NOTA: El umbral del valor CT no es absoluto; depende del agente de contraste utilizado, el tamaño del animal, la cepa, el estado de salud y el tiempo entre la inyección y la tomografía computarizada. Amide es un software de distribución libre desarrollado en nuestro instituto, pero hay otros visores de imágenes más sofisticados disponibles (por ejemplo, ORS Dragonfly²²).

En primer lugar, comparamos imágenes de TC con y sin compuerta para visualizar la calcificación cardíaca en ratones (machos, 30-32 g). El modelo murino de calcificación cardíaca fue creado mediante la inducción de lesión cardíaca por congelación-descongelación rápida del tejido cardíaco (criolesión), como se describió anteriormente²³. Con los protocolos de TC sin compuertas, las calcificaciones cardíacas se identificaron más claramente en la imagen de alta resolución (125 μm, binning 1) (Figura 11A). El CNR fue de 3,2 ± 0,3 y 4,0 ± 0,2 en las imágenes de resolución media (200 μm, agrupación 2) y alta (125 μm, agrupación 1), respectivamente. En las imágenes con compuerta (Figura 11B), el CNR fue de 4,2 ± 0,1 (solo con compuerta respiratoria) y de 5,2 ± 0,4 (con compuerta respiratoria y cardíaca). La activación respiratoria, por lo tanto, proporcionó solo un 5% de mejora con respecto a las imágenes de alta resolución (CNR 4.2 frente a 4.0). Por el contrario, la compuerta cardíaca ofreció una mejora del 30% (5,2 frente a 4,0).

A continuación, utilizamos nuestro método de TC retrospectivo con compuerta cardíaca para visualizar y cuantificar el volumen del VI durante un ciclo cardíaco en ratones C57BL/6J. Para revelar mejor el cambio en el volumen del VI durante un ciclo cardíaco, se puede encontrar un bucle en forma de video corto en el Video Suplementario S1. Durante el ciclo cardíaco, el volumen del VI al final de la sístole fue en promedio de 14 ± 4^mm3, mientras que al final de la diástole fue en promedio de 33 ± 7^mm3. Las fracciones de expulsión calculadas fueron, en promedio, de 60 ± 4%. En la Figura 10C se muestra el gráfico de volumen del VI de tres ratones. Además, nuestro método de TC retrospectivo con activación cardíaca es útil para la monitorización no invasiva de la disfunción cardíaca post-infarto en modelos murinos de lesión cardíaca isquémica aguda²⁴.

Además, los animales tenían una frecuencia cardíaca que variaba de 315 a 425 latidos/min y una frecuencia respiratoria de 25 a 50 respiraciones/min. En la Figura 12 se muestran extractos de señales respiratorias y cardíacas extraídas de proyecciones en bruto. La señal cardíaca bruta tiene una amplitud menor que la señal respiratoria y contiene parte de la señal respiratoria, que se elimina posteriormente mediante un filtro de paso de banda. El video complementario S1 muestra el corazón latiendo y proporciona una apreciación cualitativa de la afección cardíaca.

Figura 1: Resumen gráfico de la compuerta cardíaca. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; ROI = región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Vista del CrumpCAT y sus componentes principales. Abreviatura: CMOS = semiconductor complementario de óxido metálico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Preparación de los animales. (A) Se inyecta al ratón el agente de contraste, y (B) la cámara de ratón calentada a 37 °C utilizada para escanear animales¹⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Interfaz de usuario del software CrumpCAT. (A) Configuración de la interfaz de usuario para una imagen de TC sin compuerta con alta resolución (125 μm, binning 1). (B) Configuración de la interfaz de usuario para una tomografía computarizada no cerrada con resolución media (200 μm, agrupación 2). (C) Configuración de la interfaz de usuario para una imagen de TC cerrada (200 μm, agrupación 2). Para operar el escáner, el usuario debe: (1) ingresar un número de estudio, (2) seleccionar el protocolo de imágenes de TC y (3) presionar el botón Escanear . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La plantilla del tórax (corazón, caja torácica, hígado) utilizada para localizar las ventanas para extraer señales respiratorias y cardíacas. Abreviatura: ROI = región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Señal cardíaca. (A) Procesamiento de señales en el dominio de la frecuencia. La traza gris muestra el contenido de frecuencia de la señal cardíaca bruta obtenida mediante el cálculo de su espectro de potencia. Las frecuencias de interés rondan los 500/min. La traza negra muestra la señal después de aplicar un filtro de paso de banda para mantener solo las frecuencias entre 300 y 600 latidos/min. (B) Arriba: Gráfico de la señal cardíaca bruta en el dominio del tiempo. Esta señal está dominada por el movimiento respiratorio (grandes fluctuaciones); La señal cardíaca real es el movimiento débil. Abajo: Versión filtrada de la señal cardíaca: la señal respiratoria se ha eliminado dejando una señal cardíaca limpia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Señal respiratoria. Señal respiratoria bruta (arriba) y su versión de paso por banda (segunda). La señal derivada (tercera) se muestra con los cruces por cero resaltados. Estos identifican los picos en la señal respiratoria. A su vez, estos picos marcan el inicio del ciclo (valor de fase 0), como se muestra en la cuarta traza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Selección de proyección. (A) Muestra la señal respiratoria en función del número de proyección. Las proyecciones aceptadas se identifican con puntos negros. (B) Esto muestra la señal cardíaca junto con el número de fase cardíaca asignado a cada proyección. El número de fase se calcula a partir de la diferencia de tiempo entre la proyección y el comienzo del ciclo más reciente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Calcificaciones. (A) El archivo de imagen tal como se muestra con Amida con una escala de grises y con niveles de ventana de valores CT [-500, 500] HU. (B) Proceso de identificación de calcificaciones: vistas transversales, coronales y sagitales de imágenes no compuertas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Análisis del ventrículo izquierdo. (A) El ventrículo izquierdo delineado manualmente (amarillo). Frecuencia cardíaca: 418 latidos/min, frecuencia respiratoria 39 respiraciones/min. (B) El ventrículo izquierdo se umbralizó en un valor de TC de 730 HU (azul). (C) Gráfico del volumen del ventrículo izquierdo en cada fase del ciclo para tres ratones. La fracción de expulsión calculada se muestra entre paréntesis. La frecuencia cardíaca/frecuencia respiratoria para esos tres ratones fue: línea gris 362 latidos/min y 53 respiraciones/min; línea negra 420 latidos/min y 59 respiraciones/min; línea discontinua 315 latidos/min y 45 respiraciones/min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Comparación de la relación contraste-ruido. (A) imágenes sin compuertas, y (B) imágenes compuertas (frecuencia cardíaca: 408 latidos/min, frecuencia respiratoria: 49 respiraciones/min). Abreviaturas: CNR = relación contraste-ruido; R-gated = respiratorio; C-gated = cardiaco-comandado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Extractos de señales. (A) La señal respiratoria bruta extraída de la intensidad en la ventana respiratoria, y (B) la señal cardíaca bruta extraída de la intensidad en la ventana cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video Suplementario S1: Un bucle de cine de TC con compuerta cardíaca que revela el cambio en el volumen del VI durante un ciclo cardíaco en un ratón. Frecuencia cardíaca: 418 latidos/min, frecuencia respiratoria: 39 respiraciones/min. Haga clic aquí para descargar este video.

La implementación de hardware específica descrita aquí es un sistema de TC de rayos X hecho a medida exclusivo de nuestro instituto, pero el detector específico se usa ampliamente en los instrumentos de TC de rayos X preclínicos disponibles comercialmente, lo que hace que el trabajo descrito sea relevante para otras instituciones. Este sistema es funcionalmente el prototipo de dos subsistemas de microCT de rayos X in vivo disponibles comercialmente y ampliamente utilizados
en escáneres preclínicos de PET/CT. Estos escáneres microCT comparten la arquitectura y el rendimiento del detector (tamaño de píxel, sensibilidad, DQE, velocidad de fotogramas, etc.). El mismo detector también se utiliza en sistemas preclínicos PET/CT y SPECT/CT por varios otros fabricantes comerciales de sistemas preclínicos in vivo . Por lo tanto, el rendimiento del detector se comparte entre una parte significativa de los instrumentos preclínicos PET/CT y SPECT/CT disponibles e instalados comercialmente en todo el mundo. Como tal, si se programan correctamente, todos estos sistemas pueden alcanzar las mismas velocidades de fotogramas, que es el parámetro crítico que permite el trabajo descrito. Si bien la mayoría de los usuarios no tienen acceso a los datos brutos de los sistemas de microTC adquiridos comercialmente, el trabajo descrito aquí podría utilizarse como modelo para los usuarios y proveedores de instrumentos preclínicos in vivo , para demostrar lo que es posible con el hardware limitado que ya se incluye en estos instrumentos.

Además del detector, las fuentes de rayos X de tungsteno (W) también son utilizadas por prácticamente todos los sistemas preclínicos PET/CT disponibles en el mercado, con filtración de aluminio similar y rayos X con energías que oscilan entre 50 y 80 kVp. El término kVp se utiliza para describir el espectro de rayos X producidos por un voltaje nominal del tubo como el potencial de voltaje máximo proporcionado por la fuente de alimentación. Esto hace que el parámetro más importante que difiere entre todos estos sistemas sea la fuente de alimentación. En este trabajo, la potencia de la fuente (10 W) se encuentra en el extremo inferior de fuentes W similares utilizadas para la obtención de imágenes preclínicas in vivo . Por lo tanto, las fuentes más potentes deberían funcionar al menos tan bien como en el trabajo descrito y con menor ruido, o tiempos de adquisición más cortos a expensas de una dosis de radiación elevada.

Hay muy pocos artículos que exploren la activación en modelos de ratón, ya que la sabiduría convencional es que la frecuencia cardíaca del ratón (~ 600 latidos / min o ~ 10 Hz) es demasiado alta para el hardware disponible. Esta frecuencia cardíaca es para ratones conscientes, ya sea en reposo o con ejercicio completo, ya que los ratones cambian principalmente su fracción de eyección y mantienen la frecuencia cardíaca. Bajo anestesia, la frecuencia cardíaca es más baja (300-500 latidos/min). La velocidad de fotogramas del detector de 29 Hz puede reproducir completamente la extensión y el rango del movimiento periódico del corazón a cualquiera de estas velocidades. La suposición subyacente es que necesitamos satisfacer el criterio de Nyquist para el movimiento cíclico del corazón para el cual sería necesaria una velocidad de fotogramas de solo ~ 20 Hz a 600 latidos/min (10 Hz). El detector OEM concreto que hemos utilizado aquí también es utilizado por al menos cuatro fabricantes independientes de instrumentos PET/CT preclínicos y, por lo tanto, este trabajo es posible con todos estos instrumentos.

El tiempo de recirculación de la sangre en ratones es de unos pocos segundos y, por lo general, se requiere un tiempo de 2-3 minutos entre la inyección de un agente de contraste y el tiempo real de inicio de la exploración, debido a la posición del animal por encima de la cabeza, así como debido a la configuración/inicialización del hardware de rayos X y pórtico giratorio. El aspecto importante es que el usuario debe asegurarse de no retrasar el inicio del escaneo, ya que la adquisición de las 21.000 proyecciones tarda unos 10 minutos adicionales.

La duración de una sola fase cardíaca en nuestro estudio osciló entre 12 y 15 ms. Dado nuestro tiempo de exposición de 20 ms, es inevitable que haya cierta diafonía entre fases. Por ejemplo, la fase 2 puede incluir de 5 a 8 ms (divididos en partes iguales) de datos de fases adyacentes (fases 1 y 3), lo que puede causar un ligero desenfoque durante períodos de movimiento rápido, como la diástole. Para mitigar esto, es importante asegurarse de que el ratón esté correctamente anestesiado, logrando una frecuencia cardíaca inferior a 600 latidos/min (10 Hz). Además, la anestesia adecuada minimizaría el movimiento de relajación durante el tiempo de exploración relativamente largo. Las dosis de radiación recibidas por el animal, para las exploraciones con compuerta frente a las no controladas, fueron de ~450 y 50 mGy, respectivamente.

Dado que este proceso de adquisición de datos es una aplicación informática en tiempo real, es esencial que el programa de adquisición funcione con la máxima prioridad y con un mínimo de aplicaciones simultáneas en ejecución. Si no se implementan estas precauciones, los fotogramas de imagen podrían recibirse más rápido de lo que el equipo puede manejar, lo que provocaría un desbordamiento y un error en el análisis.

El principal inconveniente del método de compuerta retrospectiva es que descarta algunos datos, pero la pérdida de datos es manejable. En la práctica y con un total de 21.000 proyecciones, los datos están significativamente sobremuestreados en la dirección angular. Validamos que no había grandes espacios angulares en ningún escaneo, ciertamente mucho más pequeños que el espaciado de 0,5° que usamos para la reconstrucción de la imagen (720 proyecciones sobre 360°). Por ejemplo, con nuestra velocidad de fotogramas de 29 fps, un ratón respirando a una velocidad de 1/s y un veto del 30% de los fotogramas, rechazamos 8,7 fotogramas por respiración (es decir, el tamaño del espacio es de 8,7 fotogramas)-8,7/21600 o 0,145° por hueco. Por cierto, esta es la razón por la que se utilizó un método de reconstrucción iterativa y no Feldkamp. La consecuencia potencial secundaria del descarte de datos (en comparación con la compuerta prospectiva) es que la dosis de radiación puede aumentar porque no hay un mecanismo de obturador de hardware para bloquear el haz de rayos X durante los períodos vetados (por ejemplo, durante la fase de inspiración). Sin embargo, para que esto sea un factor, estos mecanismos de obturación deben estar completamente implementados y activos durante la activación prospectiva.

En cuanto al método de reconstrucción de datos, otros métodos pueden ser tan buenos o incluso mejores que nuestro enfoque actual con OSEM, pero el enfoque de este trabajo no es obtener las mejores y más bajas reconstrucciones posibles. En cambio, queremos demostrar que podemos realizar la activación cardíaca con un detector de uso común que tiene una velocidad de fotogramas relativamente limitada y una fuente de rayos X de baja potencia. Hemos descubierto que el uso del método de reconstrucción OSEM funciona bien dentro de las limitaciones de nuestro hardware computacional y tiene una buena implementación de trabajo.

Al mismo tiempo, nuestro método ofrece varias ventajas, incluida la simplicidad, ya que no requiere ningún hardware especial. El principal factor limitante para la implementación de nuestro método es la velocidad máxima de fotogramas de la cámara de rayos X (29 Hz) y el tiempo de exposición más corto (20 ms). La cámara se utiliza ampliamente en los instrumentos de TC de rayos X preclínicos de varios fabricantes y el método propuesto se puede utilizar con cualquier escáner que pueda alcanzar estos parámetros, incluso aquellos que no están equipados para aceptar señales de compuerta. Además, los sistemas de TC de rayos X con fuentes de rayos X de tungsteno menos potentes requieren exposiciones más largas, pero no suponen un reto insuperable. Además, los investigadores no necesitan una amplia formación y práctica en la fijación de sensores a animales pequeños para obtener la información de la respiración y el pulso, o en el ajuste fino de la activación de la señal para la adquisición de datos, como es necesario con la compuerta prospectiva.

Si bien las calcificaciones fueron visibles en todos los protocolos de imágenes de nuestro escáner CrumpCAT CT, su CNR fue más alto en las imágenes cerradas, incluso con una resolución más baja. Este hallazgo sugiere que la activación cardíaca no solo es beneficiosa para los estudios centrados en los aspectos dinámicos del corazón que late, sino que también es ventajosa para la investigación que involucra pequeñas calcificaciones cerca del corazón u otras partes anatómicas influenciadas por el movimiento fisiológico, donde una mayor claridad de la imagen es fundamental.

El tiempo total de reconstrucción es ~ 30 veces el tiempo de reconstrucción habitual debido a un mayor número de proyecciones y a tener 12 fases. Sin embargo, el paso de procesamiento de la señal añade muy poca sobrecarga (<1%) al tiempo total de reconstrucción. El propio método de reconstrucción podría mejorarse aprovechando el hecho de que los datos están correlacionados entre las fases. Una reconstrucción conjunta (a tiempo) o el uso de métodos de aprendizaje profundo²⁵ produciría imágenes con menos ruido y eliminaría la necesidad de filtros gaussianos y medianos posteriores a la reconstrucción.

El Dr. Richard Taschereau es consultor de Sofie Biosciences y Xodus Imaging. El Dr. Arion F. Chatziioannou es uno de los fundadores de Sofie Biosciences.

Agradecemos a todos los miembros del Centro de Tecnología de Imágenes Preclínicas Crump de UCLA por su ayuda y apoyo. En particular, agradecemos a Mikayla Tamboline e Isabel Day por preparar a los animales para las imágenes de TC cardíaca y agradecemos a Sophie Shumilov por generar algunas de las ROI del ventrículo izquierdo durante el estudio. También agradecemos a los Dres. Arjun Deb y Yijie Wang (UCLA) por proporcionar los modelos murinos de lesión cardíaca isquémica aguda para la obtención de imágenes de microTC de calcificación cardíaca. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Subvención del Centro Oncológico de los NIH (2 P30 CA016042-44).