Umfassende Analyse von prokoagulanzien Thrombozyten, die Merkmale von Nekrose, Apoptose und Thrombozytenaktivierung aufweisen

Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des Thrombozytenstoffwechsels und der Signalübertragung während prothrombotischer Zustände wie dem Antiphospholipid-Syndrom und Krebs mit dem Ziel, neue Biomarker und therapeutische Ziele zu identifizieren. Unsere Gruppe stand an vorderster Front des jüngsten Interesses daran, wie der Thrombozytenstoffwechsel zur Thrombozytenaktivierung und Thrombose beiträgt. Die genaue Charakterisierung des Thrombozytenaktivierungszustands im Blutkreislauf von Patienten zur Bestimmung des Thromboserisikos sowie der therapeutischen Wirksamkeit von Thrombozytenaggregationshemmern bleibt eine große Herausforderung.

Die aerobe Glykolyse, der Pentosephosphatweg und die Beta-Oxidation von Fettsäuren wurden als die charakteristischen Energiestoffwechselwege in Blutplättchen entschlüsselt und ihr Potenzial für die therapeutische Ausrichtung nachgewiesen. Dieses Protokoll dient zur Unterstützung der Identifizierung und genauen funktionellen Charakterisierung von prokoagulanzien Thrombozyten, die sich von proaggregatorischen Thrombozyten unterscheiden, sowie von Thrombozyten, die durch Apoptose oder Nekrose den Zelltod durchlaufen. Ergänzen Sie zunächst gewaschene menschliche Blutplättchen mit 2,5 millimolarem Kalzium, indem Sie 0,5 Mikroliter 0,5 molare Stammcalciumchloridlösung zu 100 Mikrolitern Thrombozytensuspension hinzufügen.

Halten Sie eine Fraktion der Blutplättchen unstimuliert und stimulieren Sie die verbleibende Fraktion mit einer Kombination aus Thrombin und Krampfstoff für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Stimulation fügen Sie jeweils einen Mikroliter eines Annexin V, einer Packung und eines Anti-CD62P-Antikörpers zu 100 Mikrolitern stimulierten Thrombozytensuspensionen hinzu. Inkubieren Sie die Blutplättchen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

Fixieren Sie nach 30 Minuten die Blutplättchen, indem Sie ein gleiches Volumen von 2 % Formalin hinzufügen, bevor Sie die Proben durch Durchflusszytometrie analysieren, um die gerinnungsfördernden Blutplättchen zu quantifizieren. Für die Herstellung von Blutplättchen gewaschene menschliche Blutplättchen auf eine Konzentration von einer Million Blutplättchen pro Milliliter verdünnen und mit 2,5 millimolarem Kalzium ergänzen. Markieren Sie die Blutplättchen mit fünf mikromolaren ROD2 für den Nachweis von mitochondrialem Kalzium und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln.

Zur Herstellung von Blutplättchen für den Caspase-Aktivierungsassay wird nach der Ergänzung der Blutplättchen mit Kalzium und der Stimulierung einer Fraktion den stimulierten Thrombozytensuspensionen eine aktive Caspase-Markierungsmatrize zugesetzt. Inkubieren Sie die Blutplättchen 30 Minuten lang im Dunkeln. Fixieren Sie nach 30 Minuten die Blutplättchen, indem Sie ein gleiches Volumen von 2% Formalin hinzufügen, bevor Sie die Blutplättchen durch Durchflusszytometrie analysieren.

Die Ergebnisse zeigen, dass Thrombin einen dosisabhängigen Anstieg des Anteils der Blutplättchen induzierte, die sowohl Phosphatidylserin als auch P-Selektin exprimieren. Die Thrombinstimulation verursachte auch einen zeitabhängigen Anstieg des mitochondrialen Kalziumspiegels in den Blutplättchen. Die Thrombinstimulation führte jedoch zu einer Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials in den Blutplättchen.

Die Thrombinstimulation aktivierte Caspase-8, aber nicht Caspase-3 oder 7 in Blutplättchen.