In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Software SciGlass verwendet, um Kryo-Elektronentomographie-Daten zu segmentieren. SciGlass ist eine Virtual-Reality-basierte Software, die eine immersive und intuitive Schnittstelle für die Segmentierung von Kryo-ET-Telegrammen bietet, wir zeigen, dass VR ein praktikables Werkzeug ist, das in Kryo-ET-Segmentierungspipelines integriert werden kann. Cryo-ET schreitet rasant voran mit, wissen Sie, Innovationen und fokussiert.
Bei dünneren Proben und schnelleren Datenerfassungsmethoden sowie bei der Verwendung von Algorithmen des maschinellen Lernens zur Verbesserung der segmentierten Partikelentnahme führen all diese Fortschritte zu einer besseren Kryo-ET und der Übernahme wirklich großartiger biologischer Erkenntnisse. Kryo-ET steht vor Herausforderungen wie Kryotechnik mit niedrigem Durchsatz. Für Proben, die dicker als 500 Nanometer sind und aufgrund der geringen Kopienzahlen nur schwer auf interessante Bereiche abzielen können.
Darüber hinaus bleibt die Datenverarbeitung ein Engpass, der umfangreiche manuelle Annotationen für die Partikelauswahl und -segmentierung erfordert, zusammen mit speziellem Fachwissen, das Sie in der Kryo-ET benötigen, so dass alles den gesamten Arbeitsablauf verlangsamt. Wir haben festgestellt, dass Virtual Reality die Segmentierungseffizienz im Vergleich zu herkömmlichen Methoden verbessert. Die immersive Umgebung ergänzt automatisierte Ansätze, indem sie Lücken schließt und Fehlalarme reduziert.
Darüber hinaus ist diese VR-Plattform sehr effektiv für Schulungen und Ausbildungen, was sie zu einem vielseitigen Werkzeug in der Kryo-ET-Datenanalyse macht. Unser Protokoll befasst sich mit der Ineffizienz der traditionellen Segmentierung, die manuelle und langsame, schwierige Prozesse umfasst. Durch die Nutzung der immersiven und intuitiven Natur der virtuellen Realität zielen wir daher darauf ab, die Segmentierung zu rationalisieren, indem wir den Prozess schneller und benutzerfreundlicher gestalten. Konvertieren Sie zunächst rohe Kryo-ET-Tomogramme in ein mit SciGlass kompatibles Datenformat, z. B. TIFF-Stacks.
Stellen Sie das Signal mit ImageJ ein, um sicherzustellen, dass die Partikel weiß auf schwarz sind. Navigieren Sie zu "Verarbeiten", gefolgt von "Kontrast verbessern", und aktivieren Sie "Histogramm ausgleichen" und "Alle Slices verarbeiten". Starten Sie die Virtual-Reality-Software auf dem Computer.
Navigieren Sie zum Menü "Datei" und wählen Sie Projekt erstellen. Klicken Sie in der Software auf Neues Projekt erstellen und dann auf Dateien hinzufügen. Navigieren Sie zum Speicherort der TIFF-Dateien und importieren Sie sie in das Projekt.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, bestätigen Sie, dass die Dateien nicht Teil einer Zeitreihe sind, nachdem Sie auf Nein geklickt haben.Weiter, weisen Sie dem Projekt einen Namen zu und klicken Sie auf Speichern", um das Projekt in der Projektliste zu erstellen. Mit einem Doppelklick auf das Projekt öffnen Sie das Tomogramm und laden es in die interaktive Virtual-Reality-Umgebung. Um Virtual Reality (VR) einzurichten, schließen Sie das VR-Headset und die Handcontroller an den Computer an.
Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die VR-Umgebung zu kalibrieren. Passen Sie das System so an, dass sich der gewünschte Bereich für die Segmentierung im Sichtfeld der VR-Umgebung befindet, und klicken Sie dann auf die Visualisierungsschaltfläche in der Softwareoberfläche. Passen Sie Visualisierungsoptionen wie Kontrast-, Fenster-, Helligkeits- und Schwellenwert-Schieberegler an, um das Signal zu verbessern und das Rauschen zu minimieren.
Ziehen Sie das Tomogramm mit den Handreglern näher heran oder schieben Sie es zur besseren Untersuchung weg. Aktivieren Sie das Schnittwerkzeug mit dem linken Controller. Betrachten Sie verschiedene Scheiben innerhalb des Tomogramms visuell.
Navigieren Sie durch das Tomogramm zum gewünschten Segment, in dem die Segmentierung beginnt. Aktivieren Sie die Option "Region-of-Interest" (ROI) im Anmerkungsmenü mit den Handcontrollern. Im Tomogramm erscheint ein grüner Kasten.
Passen Sie die Größe und Position des grünen Kastens an den zu segmentierenden Bereich an. Sperren Sie nun den ROI mit dem linken Controller. Das Werkzeug wechselt für die Segmentierung in den Malmodus.
Vergrößern oder verkleinern Sie den Tomographen für eine präzise Segmentierung. Passen Sie die Pinselgröße mit Drehungen im oder gegen den Uhrzeigersinn an, um eine optimale Kontrolle zu gewährleisten. Segmentieren Sie den interessierenden Bereich, wie z. B. die Mitochondrienmembranen, sorgfältig innerhalb des dreidimensionalen Bereichs.
Passen Sie den Ballradius entsprechend an, während Sie die Segmentierung durchführen. Aktivieren Sie den Löschmodus mit dem Trigger des sekundären Controllers, um Segmentierungsfehler zu korrigieren, und verwenden Sie die gleiche Bewegung wie bei der Segmentierung zum Löschen. Wiederholen Sie den Segmentierungsvorgang für alle Regionen, bis das Tomogramm vollständig segmentiert ist.
Nachdem Sie die Segmentierung abgeschlossen haben, klicken Sie auf das abgeschlossene Projekt, um es hervorzuheben. Klicken Sie auf die Registerkarte "Projekte" und wählen Sie "ROIs", um fortzufahren. Wählen Sie aus, ob das gesamte Volume oder ein bestimmter Interessenbereich exportiert werden soll, und geben Sie den Exportspeicherort für die segmentierten Daten an.
Laden und analysieren Sie nun die exportierten segmentierten Daten aus SciGlass in die gewünschte Software Ihrer Wahl, um die segmentierten Daten zusätzlich zu analysieren. Klicken Sie nach der Vorbereitung der Kryo-ET-Daten mit der rechten Maustaste auf das Projekt und klicken Sie auf Maskendaten hinzufügen, navigieren Sie dann zum Speicherort der ursprünglichen Segmentierung und importieren Sie sie unter demselben Projekt. Nutzen Sie die ROI-Annotation, um Änderungen an der ursprünglichen Segmentierung vorzunehmen.
Fügen Sie schließlich die Segmentierung hinzu oder löschen Sie sie, um die ursprüngliche Segmentierung zu bereinigen. Die gewichtete Rückprojektion von Tomogrammen, die mit 16 Ångström pro Pixel rekonstruiert wurden, zeigte mitochondriale und membranöse Strukturen nach Entrauschung und fehlender Keilkorrektur. Die Visualisierung in einer immersiven Virtual-Reality-Umgebung ermöglichte eine detaillierte 3D-Inspektion der Membranen, nachdem die Histogramm-Entzerrung den Kontrast erhöht hatte.
Durch die manuelle Segmentierung wurden mitochondriale und Organellenstrukturen mit hoher Genauigkeit unter Verwendung von VR-Tools abgegrenzt, einschließlich der präzisen Kartierung von Membrangrenzen und ROIs. Abschließende 3D-Renderings zeigten detaillierte mitochondriale Merkmale wie äußere und innere Membranen. Und Calciumphosphatablagerungen mit geglätteten Netzen.
