Ziel dieser Forschung ist es, die Thrombozytenfunktion unter physiologischen Bedingungen zu beurteilen. Wir untersuchen speziell die Thrombozytenfunktion mit Hilfe von mikrofluidischen Geräten und biologischen Oberflächen. Und mit diesem Ansatz konnten wir Fragen zur Thrombozytendysfunktion und zur hämostatischen Wiederbelebung für Anwendungen in der Transfusionsmedizin beantworten.
Aktuelle Thrombozytenfunktionsassays testen häufig die Fähigkeit von Blutplättchen, als Reaktion auf einen bestimmten Agonisten der Wahl zu aggregieren. Nachweismethoden können Lichtdurchlässigkeit oder elektrische Impedanz umfassen, und diese Assays können Prozessproben verwenden und werden stagnierend getestet. Durch die Verwendung dieses mikrofluidischen Ansatzes zur Überprüfung der Thrombozytenfunktion beziehen wir die Fluiddynamik ein, um die physiologische Relevanz zu erhöhen.
Die Fluiddynamik spielt eine entscheidende Rolle bei biologischen Mechanismen, die an der Thrombozytenfunktion während der Blutstillung beteiligt sind. Bei blutenden Patienten sind wir besonders besorgt über die Thrombozytenfunktion und therapeutische Interventionen, die diese Funktion verbessern können, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Mit diesem Ansatz zum Testen der Thrombozytenfunktion sind wir in der Lage, die Beiträge verschiedener Thrombozytenpopulationen in einem Experiment zu verfolgen und einen Weg zu finden, therapeutische Optionen für Traumata und andere Blutungszustände zu bewerten.
Gießen Sie zunächst die Silikonelastomerbasis in eine Wiegeschale. Geben Sie das Silikonhärter im Verhältnis zehn zu eins hinzu und rühren Sie die Mischung gründlich um, um eine ordnungsgemäße Vernetzung der Silikonpolymerketten zu gewährleisten. Legen Sie die Urform in eine Petrischale und gießen Sie das nicht ausgehärtete PDMS gleichmäßig auf die Form.
Stellen Sie dann die Petrischale für 30 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um Blasen aus der Mischung zu entfernen. Um das PDMS fertig auszuhärten, stellen Sie die Form für 90 Minuten in einen auf 70 Grad Celsius eingestellten Ofen. Schneiden Sie nach vollständiger PDMS-Aushärtung den mikrofluidischen Abdruck mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell aus.
Stanzen Sie Löcher an den Rändern der Kanäle. Lege nun den Objektträger und den Mikrofluidik-Abguss mit der geätzten Seite nach oben in einen Plasmareiniger. Starten Sie die Vakuumpumpe und verschließen Sie die Kammer.
Drehen Sie dann den Plasmareiniger auf die Einstellung "Hoch" und lassen Sie das Setup 30 Sekunden lang im Reiniger. Schalten Sie danach den Plasmareiniger aus und lassen Sie das Vakuum los. Um den plasmagereinigten Guss und den Objektträger zu binden, drücken Sie die Seiten, die im Plasmareiniger nach oben zeigten, vorsichtig zusammen.
Stellen Sie das mikrofluidische Gerät für 10 Minuten in einen Ofen oder auf eine heiße Platte bei 70 Grad Celsius, um den Bindungsprozess abzuschließen. Beschichten Sie nun die mikrofluidische Kammer mit einem Typ-1-Reagenz für fibrilläre Pferdekollagen durch einen dafür vorgesehenen Auslass zum vorgesehenen Einlass. Lagern Sie das Gerät in einem warmen, feuchten, geschlossenen Behälter, um zu verhindern, dass das beschichtete Kollagen im Kanal verdunstet.
Spülen Sie das Gerät nach einer Stunde mit PBS in die entgegengesetzte Richtung der Beschichtung, um die Kollagenlösung auszuspülen. Inkubieren Sie zunächst citriertes Vollblut mit einem fluoreszenzkonjugierten CD41-Antikörper unter Verwendung eines Fluorophors Ihrer Wahl. Färben Sie das Blut 30 Minuten lang auf einer Nutwieppe.
Schalten Sie anschließend das Mikroskop und die zugehörige Software ein. Stellen Sie die Entnahmespritzenpumpe auf eine Höhe mit dem Mikroskoptisch ein und passen Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe entsprechend den experimentellen Anforderungen an. Platzieren Sie dann das mikrofluidische Gerät auf dem Mikroskoptisch und kleben Sie seine Kanten mit Klebeband an den Tisch, um Bewegungen zu verhindern.
Verbinden Sie nun den Schlauch mit einem Innendurchmesser von einem Sechzehntel Zoll mit einem Winkelanschluss und dann mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einem Anschluss von einem Sechzehntel Zoll Innendurchmesser. Füllen Sie die 10-Milliliter-Spritze mit sterilem PBS und schließen Sie sie an die Spritzenpumpe an. Stecken Sie dann den Winkelstecker in die Steckdose des mikrofluidischen Geräts.
Bereiten Sie etwa 10 Zentimeter lange Einlaufleitungen mit einem Winkelverbinder an einem Ende und einem abgewinkelten Schnitt am anderen Ende vor. Verbinden Sie nun den Einlasswinkelstecker mit dem Geräteeinlass und positionieren Sie die Einlassleitung in ein Abfall-Mikrozentrifugenröhrchen, das auf einem abgewinkelten Halter platziert ist. Verwenden Sie die 10-fache Objektivlinse, um auf die Kanalkanten des mikrofluidischen Geräts zu fokussieren.
Als nächstes grundieren Sie die Linien mit PBS. Schieben Sie die Spritzenpumpe manuell vor, um den Kanal von PDMS oder Schmutz zu befreien. Überprüfen Sie die Nähe des Kanaleinlasses und -auslasses auf Verstopfungen.
Öffnen Sie nun die gespeicherten Bildaufnahmeeinstellungen oder erstellen Sie ein neues Bildaufnahmeverfahren für Zeitreihenbilder, die alle ein bis zwei Sekunden mit einem Hellfeldkanal und Fluoreszenzkanälen aufgenommen werden, die den CD41-Antikörpern in der Blutprobe entsprechen. Entnehmen Sie die gefilterte Citratblutprobe und mischen Sie sie, indem Sie sie kurz vor Beginn des Experiments auf und ab pipettieren. Legen Sie die Probe auf den abgewinkelten Mikrozentrifugenhalter.
Positionieren Sie dann die Einlassleitung in der Blutprobe und beginnen Sie mit der Aufnahme der Bildaufnahme. Ziehen Sie die Spritze langsam heraus, um das Totvolumen im Schlauch zu füllen. Sobald das Blut den Kanal erreicht, drücken Sie sofort auf Play an der Spritzenpumpe, um den Fluss mit der gewünschten Geschwindigkeit fortzusetzen.
Führen Sie das Experiment durch, bis die Blutplättchen den stenotischen Bereich des mikrofluidischen Geräts vollständig verschlossen haben oder bis zum experimentellen Endpunkt, der in der Regel bei 10 Minuten liegt. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, stoppen Sie die Bildaufnahme und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Speichern Sie abschließend die Bildaufnahme auf dem entsprechenden Speicher.
