Die Forschung bewertet die Glukosekonzentration in mikrobiellen Proben unter Verwendung von Quantifizierungstechniken von Bakterien- und Hefefiltern. Ziel ist es, die Genauigkeit des Glukosemassengramms in mikrobiologischen Studien zu verbessern. Zu den Herausforderungen gehören die genaue Quantifizierung niedriger Glukosekonzentrationen in komplexen mikrobiellen Proben und die Unterscheidung zwischen mikrobiellen und umweltbedingten Glukosequellen in Mischkulturen.
Die Forschung hat eine klare Korrelation zwischen bestimmten mikrobiellen Stämmen und ihren Glukoseverbrauchsraten gezeigt und gezeigt, wie Umweltfaktoren die Stoffwechselwege beeinflussen. Unser Protokoll verbessert den Glukosenachweis, indem es die Spezifität und Sensitivität verbessert und gleichzeitig die Verarbeitungszeit verkürzt. Der kontrollierte Einsatz von Schwefelsäure minimiert Interferenzen.
Zukünftige Forschungsarbeiten werden sich auf die Optimierung von Glukosenachweismethoden für industrielle mikrobiologische Anwendungen konzentrieren und die Rolle eines bestimmten Gens im Glukosestoffwechsel unter verschiedenen Umweltbedingungen untersuchen. Wiegen Sie zunächst 1,28 Gramm Kaliumdihydrogenphosphat und 0,1304 Gramm Dikaliumphosphat in einem Becherglas. Fügen Sie 70 Milliliter entionisiertes Wasser hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit 1 molaren Salzsäure oder Kaliumhydroxid auf 5,5 ein.
Dann wird die Lösung in einen 100-Milliliter-Messkolben umgefüllt und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 Milliliter eingestellt. Lagern Sie die vorbereitete Lösung in einem braunen Behälter bei 4-8 Grad Celsius bis zu drei Monate. Wiegen Sie anschließend 0,01 Gramm o-Dianisidindihydrochlorid in einem 2-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette 1 Milliliter deionisiertes Wasser hinzu, um die Verbindung aufzulösen, und mischen Sie die Lösung langsam. Wickeln Sie das Zentrifugenröhrchen in Alufolie ein, um es vor Licht zu schützen, und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. Dann wird o-Dianisidindihydrochloridlösung zu 10 Millilitern Phosphatpuffer gegeben, die in einem 100-Milliliter-Messkolben eingenommen werden, und das Endvolumen mit dem Phosphatpuffer auf 100 Milliliter eingestellt.
Nachdem Sie die Lösung in einen braunen Kolben umgefüllt haben, lagern Sie sie 3-4 Monate lang bei 4-8 Grad Celsius. Stellen Sie nun einen 100-Milliliter-Messkolben mit 30 Millilitern entionisiertem Wasser in ein Eisbad. Nach 10 Minuten werden langsam 51 Milliliter 98%ige Schwefelsäure durch leichtes Schütteln an den Wänden des Kolbens gegossen.
Später stellen Sie das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 Milliliter ein und geben Sie die Lösung zur Lagerung in einen Braunkolben aus Glas. Wiegen Sie zur Enzymvorbereitung 0,01 Gramm Glukoseoxidase in einem sterilen 2-Milliliter-Mikroröhrchen. 1 Milliliter 50-Millimolar-Natriumacetat-Puffer bei pH 5 in das Mikroröhrchen geben und vorsichtig mischen.
Wiegen Sie dann in einem neuen 2-Milliliter-Mikroröhrchen 0,0031 Gramm Peroxidase-Enzym und lösen Sie es in 1 Milliliter Phosphatpuffer auf, der auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt ist. Decken Sie beide Mikroröhrchen mit den Enzymen mit Alufolie ab und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie dann 1 Gramm pro Liter D-Glucose-Standardlösung mit entionisiertem Wasser vor.
Bereiten Sie zunächst den Glukosestandard und alle anderen erforderlichen Lösungen für den Assay vor. Geben Sie die entsprechende Menge Glukose in frische 2-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie ein trockenes Thermobad auf 37 Grad Celsius ein und lassen Sie es stabilisieren.
Geben Sie die entsprechenden Volumina Puffer in jedes Mikroröhrchen, gefolgt von 3,3 Mikrolitern der Glukoseoxidase und 1,2 Mikrolitern Peroxidase. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius und stellen Sie den Timer auf 20 Minuten. Geben Sie unmittelbar nach der Inkubation 750 Mikroliter 50%ige Schwefelsäure in jedes Mikroröhrchen und legen Sie sie zum Abkühlen 2 Minuten lang in ein Eisbad.
Füllen Sie das abgekühlte 1.500-Mikroliter-Gemisch in eine Kunststoffküvette und messen Sie die Extinktion bei 529 Nanometern. Reinigen Sie dann den Arbeitsbereich mit einer 70%igen Alkohollösung und zünden Sie einen Brenner an, um die Asepsis zu gewährleisten. Gewinnen Sie Bakterien oder Hefen in einem flüssigen Nährmedium.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur mit sterilen Spitzen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Die Proben werden bei 7.500 g 7 Minuten lang bei 4 Grad Celsius zentrifugiert. Nach der Zentrifugation ist der Überstand, der Glukose in Lösung enthält, vorsichtig zu entfernen.
Mischen Sie 0,5 Mikroliter des Überstands mit allen erforderlichen Komponenten, um das Reaktionsgemisch herzustellen. Inkubieren Sie die Mikroröhrchen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fügen Sie sofort 750 Mikroliter 50%ige Schwefelsäure hinzu. Lass die Mischung 2 Minuten in einem Eisbad abkühlen.
Messen Sie abschließend die Extinktion bei 529 Nanometern. Die spektrophotometrische Analyse ergab einen maximalen Absorptionspeak bei 529 Nanometern. Die Analyse des Glukoseverbrauchs mit Debaryomyces hansenii zeigte konsistente Ergebnisse zwischen Glukoseoxidase und DNS-Methoden, bis nach 6, 8 und 12 Stunden signifikante Unterschiede auftraten.
Die Anwendung der Glukoseoxidase-Schwefelsäure-Methode ermöglichte die Analyse hoher Glukosekonzentrationen von bis zu 100 Gramm pro Liter, mit zuverlässigen Ergebnissen nach der Verdünnung.
