Vorläuferzellen interagieren also mit der Umgebung, um die Homöostase des Gewebes aufrechtzuerhalten. Und mit diesem Protokoll können wir anfangen zu verstehen, wie Fibroblasten das Verhalten von Vorläuferzellen der Speiseröhre beeinflussen. Das Co-Kultursystem verwendet zunächst isolierte Zellen, die die normale Vorläufernische des Ösophagus nachahmen.
Die Klärung der Organoide vor der Bildgebung ermöglicht die Analyse sowohl der Zellinteraktionen als auch der Organoidmorphologie. Diese Methode könnte auf humane Ösophagusorganoide angewendet werden. Zum Beispiel mit Materialien von gesunden oder Krebspatienten.
Auf diese Weise können wir Einblicke in die spezifische Funktion von krebsassoziierten Fibroblasten gewinnen. Die Dissoziation von Epithel- und Stromazellen ist entscheidend, um lebensfähige Organoide zu erhalten. Eine Unterverdauung führt zu einer geringen Zellausbeute, während eine Überverdauung die Lebensfähigkeit der Zellen und die Fähigkeit zur Bildung von Organoiden verringert.
Zunächst wird die Muscularis externa mit einem Präpariermikroskop und einer Pinzette mechanisch aus der Speiseröhre entfernt. Halten Sie das distale Ende der präparierten Speiseröhre mit einer Pinzette fest und verwenden Sie die andere Pinzette, um den Muskel vom distalen zum proximalen Ende der Speiseröhre zu greifen und zu ziehen. Entfernen und entsorgen Sie die Muskelschicht.
Um die Speiseröhre in Längsrichtung zu öffnen, halten Sie ein Ende der Speiseröhre fest und führen Sie die Kugel der Mikrodissektionsfederschere in das Lumen ein, um Gewebeschäden zu vermeiden. Schneiden Sie die Speiseröhre auf, während Sie sich am Ende festhalten, und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen oder eine 24-Well-Platte. Tauchen Sie die geöffnete Speiseröhre in 0,5 Milligramm pro Milliliter Thermolysin in HBSS und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius auf einem Wippenschüttler für 15 Minuten.
Nach der Entnahme des Ösophagus aus der Thermolysinlösung das Ösophagusepithel vorsichtig vom Stroma trennen. Übertragen Sie die Epithel- und Stromaschicht in zwei separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Dissoziationslösung in HBSS und legen Sie sie auf Eis. Zerkleinern Sie das Speiseröhreneithel mit einem scharfen Skalpell und entnehmen Sie das gehackte Gewebe mit 200 Mikrolitern Dissoziationslösung aus der Petrischale.
Übertragen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 800 Mikroliter frische Dissoziationslösung hinzu und legen Sie das Röhrchen mit der zerkleinerten Epithelschicht für 60 Minuten auf einen Wippenschüttler bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie die Lösung alle 15 Minuten etwa 20 Mal mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf und ab.
Schneiden Sie die Stromaschicht in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern Dissoziationslösung mit einer Dissektionsschere in feine Stücke und geben Sie 800 Mikroliter frische Dissoziationslösung hinzu. Legen Sie die Tube für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius auf einen Wippshaker. Nach 30 Minuten Inkubation für Stromalösung und 60 Minuten Inkubation für Epithellösung pipettieren Sie die Lösung weitere 20 Mal auf und ab.
Die Stromalösung wird durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb und die Epithellösung durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in neue 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen geleitet. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 G bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Ein-Milliliter-Pipette entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Antikörpermischung.
Nachdem Sie das Gemisch in ein Durchflusszytometrieröhrchen umgefüllt haben, inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Fügen Sie drei Milliliter 1%FBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in mindestens 200 Mikrolitern 1%FBS.
Fügen Sie fünf Minuten vor der Faxsortierung einen bis 10.000 verdünnte Dead-Cell-Färbungsmarker hinzu, um die lebenden Zellen zu isolieren. Mischen Sie die sortierten Epithelzellen und Fibroblasten im Verhältnis eins zu zwei in einem Röhrchen. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei 300 G ist der Überstand zu entsorgen, indem Sie ihn vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette entfernen.
Waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie das Pellet in kaltem, basischem organoidem Medium resuspendieren und erneut fünf Minuten lang zentrifugieren. Legen Sie die Zellen auf Eis und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Mikrolitern Matrixmischung pro Kuppel und legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis.
Nehmen Sie die vorgewärmte 48-Well-Platte aus dem 37 Grad Celsius-Inkubator und machen Sie eine Matrixkuppel pro Well. Geben Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette 200 Mikroliter vorgewärmtes ER-niedriges Medium zu den Matrixkuppeln, die Organoid-Kokulturen enthalten, und ENR-Medium zu den jeweiligen Matrixkuppeln, die nur epitheliale Organoide enthalten. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Ergänzen Sie das Medium in den ersten zwei Tagen mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren. Entfernen Sie das Organoidmedium und geben Sie 200 Mikroliter eiskaltes PBS in die Matrixkuppeln. Nachdem Sie die Platte fünf bis 10 Minuten lang auf Eis gelegt haben, pipettieren Sie auf und ab und übertragen Sie die Lösung in ein nicht haftendes 0,6-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie kurz für 30 bis 60 Sekunden bei 100 G, damit sich die Organoide am Boden absetzen können. Nachdem Sie die überschüssige Flüssigkeit entfernt haben, geben Sie eiskaltes PBS in das Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut für 30 bis 60 Sekunden. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit wie zuvor gezeigt und fixieren Sie das Organoid mit 200 Mikrolitern kaltem, 4%igem Formaldehyd in PBS-Lösung für 30 Minuten auf Eis.
Stellen Sie das Röhrchen aufrecht, um das Organoid sinken zu lassen und das Formaldehyd zu entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter kaltes PBS hinzu, um das restliche Formaldehyd wegzuwaschen. Nachdem Sie das überschüssige PBS entfernt haben, fügen Sie 500 Mikroliter Blockierpuffer hinzu.
Legen Sie die Tube für 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Wippshaker. Entfernen Sie den Blocking-Puffer und resuspendieren Sie die Organoide in 200 Mikrolitern Blocking-Puffer mit primären Antikörpern. Legen Sie die Organoide über Nacht bei vier Grad Celsius wieder auf einen Wippshaker.
Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Organoide mit 500 Mikrolitern 0,02 % Triton x 100 in PBS 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dies dreimal. Entfernen Sie ebenfalls den Waschpuffer und geben Sie über Nacht bei vier Grad Celsius 200 Mikroliter fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper in den Blockierungspuffer.
Waschen Sie die Organoide erneut mit 0,02 % Triton x 100 in PBS, gefolgt von 500 Mikrolitern PBS. Nachdem Sie die überschüssige Flüssigkeit entfernt haben, geben Sie 10 Mikroliter Reinigungslösung zu den Organoiden und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie einen doppelseitigen, klebrigen Vier-Well-Abstandshalter von 0,05 Millimetern auf einen Objektträger.
Geben Sie die 10 Mikroliter Reinigungslösung mit den Organoiden in eine Vertiefung und legen Sie ein Deckglas auf den Abstandshalter. Erfassen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskopiesystem. Ösophagus-Vorläuferzellen werden anhand ihrer hochintegrierten Beta-Vier- und e-Cadherin-Expression sortiert.
Das repräsentative durchflusszytometrische Diagramm der Epithelzellisolierung zeigt den prozentualen Anteil lebender Zellen aus allen Einzelzellen. Der prozentuale Anteil der isolierten Integrin-beta-vier- und e-Cadherin-Vorläuferzellen aus allen lebenden Zellen ist hier dargestellt. Die hier gezeigten durchflusszytometrischen Diagramme stellen den Prozentsatz der isolierten DPP4+- und Pdgf-Rezeptor-alpha-positiven Fibroblasten dar.
Die Hellfeldbilder mit den Organoiden, die mit Pdgf-Rezeptor alpha H2 BEGFP-positiven Fibroblasten kokultiviert wurden, zeigen das nukleäre EGFP-Signal. Die Hellfeldbilder der gesamten Matrixkuppel am sechsten Tag sind hier zu sehen. Die Effizienz der Organoidbildung wird durch dieses grafische Bild dargestellt.
Jeder Punkt stellt eine Matrixkuppel dar, und der Balken stellt den Mittelwert aller Punkte pro Bedingung dar. Die Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von Tag-Sechs-Organoiden, die mit Pdgf-Rezeptor-alpha-positiven Fibroblasten kokultiviert werden, sind hier zu sehen. Die Gesamtmontagebilder der kokultivierten Organoide zeigen 3D-Oberflächen der Organoide mit Vimentin-positiven Fibroblasten, die um das Organoid gewickelt sind und in engem Kontakt mit ihm stehen.
Die Whole-Mount-Färbung von mono- und co-kultivierten Organoiden mit Pdgf-Rezeptor-alpha-positiven Fibroblasten zeigt unterschiedliche basale und suprabasale Zellpopulationen. Die Organoidbildungseffizienz sowie die Organoidgröße werden durch die in die Co-Kultur aufgenommenen Fibroblasten beeinflusst. Variationen und Ergebnisse sind bei der Verwendung verschiedener Fibroblasten-Subpopulationen zu erwarten.
Die gleiche Strategie kann zur Charakterisierung tumorassoziierter Fibroblasten sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen angewendet werden.
