Das Darmmikrobiom spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Physiologie des Wirts. Dieses Protokoll ermöglicht insbesondere die Hochdurchsatzbewertung der Besiedlung von fluoreszierenden Darmmikroben in einzelnen, zellulären Tieren in großem Maßstab. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, das Darmmikrobiom von lebenden Tieren in Echtzeit zu überwachen, was die Identifizierung und Korrelation von Veränderungen mit der Physiologie des Wirts ermöglicht.
Das Verfahren wird von Dana Blackburn, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Waschen Sie zunächst die Würmer mit ein bis zwei Millilitern M9-TX vom Bakterienrasen. Die Würmer werden auf eine sterilisierte, zwei Milliliter tiefe Platte mit einer Tiefe von 96 Löchern gegeben.
Pelletieren Sie sie eine Minute lang mit 300 g und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Ansaugverteiler. Geben Sie mit einer 1,2-Milliliter-Mehrkanalpipette 1,8 Milliliter M9-TX in jede Vertiefung der Tiefbrunnenplatte, die durch mehrmaliges Pipettieren gemischt wurde, und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 300 g. Nach der letzten Wäsche wird das Volumen in jeder Vertiefung mit dem Ansaugverteiler auf 100 Mikroliter gebracht.
Geben Sie 100 Mikroliter 10 Millimolar Levamisol und M9-T in jede Vertiefung und lassen Sie die Würmer fünf Minuten lang lähmen. Geben Sie dann zwei Minuten lang 4%ige Bleichlösung in jede Vertiefung, um Bakterienklumpen zu reduzieren. Geben Sie nach der Bleichbehandlung M9-TX in jede Vertiefung der Platte, um die Würmer zu waschen.
Zentrifugieren Sie die Platte und saugen Sie nach dem zweiten Waschen auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern ab. Die Würmer werden auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben, die 150 Mikroliter 10 Millimol Levamisol und M9-TX enthält. Halten Sie die Wurmdichte bei 50 bis 100 Würmern pro Well und teilen Sie die Würmer auf mehrere Löcher auf, wenn die Population zu überfüllt ist.
Schalten Sie den Luftkompressor, den Computer und das LPS-Instrument ein. Überprüfen und entleeren Sie den Fäkalientank. Prüfen und füllen Sie die Mantel- und Wassertanks nach, wenn das Volumen gering ist.
Stellen Sie sicher, dass die fluidische und optische Kernbaugruppe mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern an Ort und Stelle ist. Schließen Sie den Autosampler an und schalten Sie ihn ein. Öffnen Sie die Autosampler-Gerätesoftware, um den Autosampler und die LPS-Software zu öffnen.
Wechseln Sie im LPS-Softwarefenster zu Datei, klicken Sie auf Neues Experiment, wählen Sie dann erneut Datei aus, und klicken Sie auf Neue Stichprobenprüfung. Aktivieren Sie das Einschalten von 488- und 561-Nanometer-Lasern durch Laser, falls dies noch nicht geschehen ist. Erstellen Sie nun Vorlagen für Erfassungspunktdiagramme unter Verwendung von Laufzeit-, Extinktions- und Fluoreszenzkanälen im LPS-Softwarefenster.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Text eines Diagramms, um die Skalierung zu ändern. Laden Sie als Nächstes die Kontrollbeispiele. Wählen Sie im Autosampler-Fenster Prime aus, gehen Sie zu Datei, klicken Sie auf Skript öffnen, um das richtige integrierte Skript auszuwählen, und klicken Sie auf OK.
Gehen Sie im Menü der Probenahmesoftware zur Plattenvorlage, um die gewünschten Vertiefungen für die Analyse auszuwählen. Nachdem Sie die Platte in den Autosampler-Tisch geladen und gesichert haben, drücken Sie im Autosampler-Fenster auf Run Plate und speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Aktuelle Daten speichern" im oberen Menüband im LPS-Softwarefenster und speichern Sie die Daten erneut. Öffnen Sie die LPS-Software.
Navigieren Sie zu Datei, wählen Sie Neues Experiment aus, kehren Sie dann zu Datei zurück, und klicken Sie auf Neues Beispiel. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit der Laufzeit auf der X-Achse und der Extinktion auf der Y-Achse. Erstellen Sie ein weiteres Punktdiagramm mit der Laufzeit auf der X-Achse und Rot auf der Y-Achse.
Stellen Sie sicher, dass die Laser die 488- und 561-Nanometer-Laser aktivieren können. Positionieren Sie das Kontrollprobenröhrchen auf dem Probenanschluss und klicken Sie dann im Dialogfeld "Erfassen und Dispensieren" auf "Erfassen". Wenn Sie dazu aufgefordert werden, stellen Sie sicher, dass Sie die Datei speichern.
Sobald genügend Würmer gemessen wurden, um die Populationen zu unterscheiden, wählen Sie im Punktdiagramm, das die Fluchtzeit im Vergleich zum Aussterben zeigt, Abbruch aus. Zeichne ein Tor um den Bereich, der die erwachsene Bevölkerung repräsentiert. Navigieren Sie dann zur Ansicht, klicken Sie auf Gating-Hierarchie und überprüfen Sie, ob die fluoreszierenden Gatter unter dem Adult-Populations-Gate korrekt aufgeführt sind.
Erstellen Sie im Vergleich zum Rotpunktdiagramm im Vergleich zur Flugzeit Tore um die Bereiche mit hohem und niedrigem Rotwert, um die interessierenden Regionen hervorzuheben, die eine Mikrobiombesiedlung bei erwachsenen Würmern zeigen. Sobald die Einstellungen optimiert sind, fahren Sie mit Datei fort, klicken Sie auf Experiment speichern, klicken Sie dann auf Datei und wählen Sie Beispiel speichern aus. Um das Sammelgerät zu beladen, wählen Sie die Ladeplatte A, damit sich die Entnahmestufe in eine Position bewegen kann, die für das Laden eines Sammelröhrchens oder einer 96-Well-Platte vorbereitet ist.
Um auf eine 96-Well-Platte zu dosieren, gehen Sie zum Einrichtungsbereich und wählen Sie Platten aus, klicken Sie dann auf kalibrierte Platten und wählen Sie 96-Well-Platte. Wählen Sie als Nächstes die Vertiefungen aus, in die die Würmer sortiert werden sollen, und geben Sie die Anzahl der zu sortierenden Objekte in jede Vertiefung ein. Stellen Sie sicher, dass Sie auch die abgegrenzten Bereiche von Interesse angeben.
Wenn es mehrere abgegrenzte Bereiche gibt, die in dieselbe Platte einsortiert werden, stellen Sie sicher, dass Sie das Kontrollkästchen mit der Markierung Gate für jede Vertiefung aktivieren. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu speichern. Nachdem Sie die Nummern sortiert und die Positionen zugewiesen haben, laden Sie die Probe in den Probenanschluss und klicken Sie auf die Schaltflächen zum Füllen der Platte im Dialogfeld "Erfassen und Dispensieren", um die Abgabe in eine 96-Well-Platte zu starten.
Bei erwachsenen Tieren werden höhere Ausdehnungs- und Flugzeitwerte beobachtet als bei Larven. Nachkommen von zwei Tage alten Erwachsenen wurden von L1- und L2-Stadien dominiert, während die meisten Nachkommen von drei Tage alten Erwachsenen L3- und L4-Stadien erreichten. Beim Anbau auf E. coli stiegen die Flugzeit- und Verlängerungswerte am dritten Tag im Vergleich zum zweiten Tag an.
Beim Anbau auf Ochrobactrum, BH 3 und Mischkulturen zeigten Cenor abdidas allegands Unterschiede in der Flugzeit und den Ausdehnungswerten. In der Mischbedingung wurde eine erhöhte BH3-Besiedlung von Ochrobactrum beobachtet als in Ochrobactrum BH3 allein. Im Gegensatz dazu zeigten grüne, fluoreszierende Werte eine geringere OP50-Besiedlung im Mischzustand als in OP50 allein.
Die Würmer sind stark in Richtung der Y-Achse verzerrt, was darauf hindeutet, dass die OP50-Kolonisierung bei den meisten Würmern gering ist, während die Besiedlung mit Ochrobactrum und BH3 gleichmäßig in der Population verteilt ist. Der Zusammenhang zwischen Ochrobactrum, BH3-Kolonisierungsgrad und der Entwicklung des Wirts, wie z.B. der Körperdichte und den Unterschieden in den Fortpflanzungsmustern, wurde ebenfalls beobachtet. Die drei Tage alten Erwachsenen, die mit dem Mikrobiom aus zwei Mitgliedern gezüchtet wurden, zeigten eine große Bandbreite an RFP-Intensitäten, was auf individuelle Variationen in der Ochrobactrum-Kolonisierung innerhalb der Gruppe hindeutet.
Es werden RFP-Bilder der Bohrungen gezeigt, die 15 sortierte und einzelne Würmer aus hohen und niedrigen RFP-Gattern enthalten. Das Wichtigste ist, daran zu denken, für alle Schritte geeignete Steuerelemente zu verwenden, um sicherzustellen, dass das Protokoll und der Computer ordnungsgemäß funktionieren. In Echtzeit können Tiere mit spezifischen Merkmalen verwendet werden, um Stämme aus Wirts- oder mikrobiellen Mutantenpools zu isolieren, um Gene zu identifizieren, die postmikrobielle Interaktionen regulieren.
Isolierte Tiere können auch für Einzeltier- oder angereicherte phänotypische Pool-basierte Downstream-Analysen wie RNA-seq oder dergleichen verwendet werden. Wirklich, die Möglichkeiten sind wirklich endlos.
