Mit dem beschriebenen Protokoll können wir den linken Ventrikel des Spenderherzes und die Funktion des Ventrikels nach der Konservierung vergleichen und den Unterschied in der Konservierungsbiologie in beiden Ventrikeln während dieses Konservierungsprozesses untersuchen. Bei dieser Technik wird ein Ex-vivo-Perfusionssystem verwendet, um die Herzfunktionen nach der Konservierung zu untersuchen. Es bietet ein robustes und zuverlässiges Werkzeug für das Screening neuer Behandlungen, um die Herzfunktionen von Spendern nach der Konservierung zu verbessern.
Beginnen Sie mit der Zubereitung des Teigs, wie im Text beschrieben, und formen Sie ein kleines Stück des Teigs in eine ovale Form, um den Kopf zu erhalten. Befestigen Sie es am Ende eines trockenen Spaghettistrangs. Tauchen Sie den Kopf in die bereits zubereitete Zuckerlösung und entfernen Sie ihn langsam, sobald er gut mit einem dünnen Film der Lösung bedeckt ist.
Hängen Sie dann den Spaghettistrang an einen Styroporschaumblock oder andere Halterungen, damit sich eine gleichmäßige und glänzende Hülle über dem Kopf bildet, und trocknen Sie ihn über Nacht. Am nächsten Tag tauchen Sie die Form in in Xylol dispergiertes Silikonelastomer und legen den Spaghettistrang bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden oder bis zum Trocknen wieder in den Styroporschaumblock. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
Legen Sie dann die Form in das Wasser, um den Ballon zu trennen und aufzufangen. Bewahren Sie den Ballon in 0,02%igem Natriumazid auf. Schneiden Sie nun eine zweifache Spitze von einer 22-Gauge-Nadel ab und befestigen Sie ein stumpfes Ende am Silikonballon, während das andere stumpfe Ende an einem PE-Schlauch befestigt ist.
Verwende eine 4-0-Seidennaht, um den Ballon auf der Nadel festzubinden. Nehmen Sie die C57Black/6-Maus und injizieren Sie intraperitoneal 200 Einheiten Heparin in den Bauch des Tieres zur Antikoagulation. Nachdem Sie die richtige Anästhesie mit einer Zehenkneifung bestätigt haben, machen Sie einen Schnitt direkt unter dem Brustbein.
Und öffnen Sie mit einer Schere den Brustkorb, indem Sie das Zwerchfell in die Rippen schneiden. Falten Sie dann die vordere Brustwand, um den Brustkorb vollständig freizulegen, bevor Sie einen Schnitt an der absteigenden Aorta in der Nähe des Aortenbogens machen. Übertragen Sie nun das Herz, die Lunge und den Thymus der Maus in eiskaltes Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat oder HTK-Puffer, um die Organe zu isolieren.
Legen Sie die Aorta frei, indem Sie jegliches Bindegewebe entfernen. Verbinden Sie das Ende der Aorta mit einer 22-Gauge-Nadel und binden Sie sie mit einem 6-0-Seidenfaden zusammen. Stellen Sie sicher, dass sich die Kanüle über der Aortenwurzel befindet, um die Aortenklappe nicht zu beeinträchtigen.
Die Aorta ca. 10 Minuten lang mit 10 Millilitern HTK-Puffer perfundieren, der auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Je nach Art des Experiments wird das Herz entweder acht Stunden lang in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem HTK aufbewahrt oder die Überfülle sofort durchgeführt. Um eine Überreichung durchzuführen, wird das Nadelherz mit der Kanüle im Langendorff-Apparat verbunden und mit einem Seidenfaden abgebunden.
Beginnen Sie die Profusion in einem konstanten Durchflussmodus mit drei Millilitern pro Minute und stellen Sie dann nach dem Wechsel in einen konstanten Druckmodus bei 70 bis 80 Millimetern Quecksilbersäule die Perfusionsrate auf etwa sechs Milliliter pro Minute ein. Als nächstes schließen Sie einen entleerten, mit Wasser gefüllten Silikonballon mit einem Druckwandler und einer mit Wasser gefüllten Spritze über einen Drei-Wege-Wasserhahn an. Nach 15 bis 20 Minuten einer Äquilibrierungsphase nach der vorangegangenen Perfusion durchtrennen Sie den rechten Vorhof oder RA und führen den Ballon durch die RA in die rechte Herzkammer oder RV ein. Verwenden Sie Klebeband, um den Ballon im Wohnmobil zu halten, und minimieren Sie den offenen Bereich der RA, um den Ballon in der Herzkammer einzuschränken.
Nach 20 Minuten funktioneller Datenerfassung für das RV durchtrennen Sie den linken Vorhof oder LA und führen einen entleerten, mit Wasser gefüllten Ballon durch den LA in den linken Ventrikel oder LV ein. Halten Sie den Ballon mit Klebeband im Inneren des LV.To kalibrieren Sie den Druckwandler, füllen Sie zuerst eine 10-Milliliter-Spritze mit warmer Kochsalzlösung und verbinden Sie die Spritze über einen Drei-Wege-Wasserhahn mit der Kuppel. Öffnen Sie den Wasserhahn und füllen Sie die Kuppel langsam mit Kochsalzlösung, bevor Sie alle Hähne schließen und die Spritze entfernen. Befestigen Sie dann die gefüllte Kuppel am Messumformer, indem Sie das Manometer an das dritte Ende des Dreiwegehahns anschließen.
Wählen Sie in der Aufnahmesoftware im Dropdown-Menü des Kanals, der mit dem Wandler verbunden ist, die Option Brückenverstärker aus. Klicken Sie vor dem Start der Aufnahme auf 0, um den Messwertwert des Wandlers auf null Millimeter Quecksilbersäule einzustellen. Schieben Sie nach einigen Sekunden der Aufzeichnung langsam auf die Spritze und erhöhen Sie den Druck auf 100.
Klicken Sie auf Stopp, um die Aufnahme zu beenden. Wählen Sie im Dialogfeld "Einheitenumrechnung" den Aufzeichnungsbereich für null Millimeter Quecksilber aus und klicken Sie auf den Pfeil 1, bevor Sie null Millimeter Quecksilbersäule eingeben. Wählen Sie in ähnlicher Weise den Aufnahmebereich für 100 Millimeter Quecksilber aus.
Klicken Sie auf den Pfeil 2 und geben Sie 100 Millimeter Quecksilbersäule ein. Klicken Sie nun auf OK, um den Wandler zu kalibrieren. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, benennen Sie den Kanal, der dem Druckwandler mit dem Ballon entspricht, in Ventrikeldruck oder LV-Druck um und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, wenn das Herz an das System angeschlossen ist.
Nachdem Sie den Ballon in die Herzkammer eingeführt haben, stellen Sie das Wasservolumen im Ballon mit einer Mikrometerspritze durch den Drei-Wege-Wasserhahn ein, um den enddiastolischen Druck bei fünf bis 10 Millimetern Quecksilbersäule zu halten. Benennen Sie als Nächstes einen leeren Kanal in dP/dt um und behalten Sie den abgeleiteten Quellkanal als Ventrikeldruck bei. Dieser Kanal zeichnet das Verhältnis der Druckänderung in der Ventrikelhöhle während der Kontraktion auf.
Wählen Sie die stabile Messdauer aus, bevor Sie im Blutdruckmodul zur Einstellung gehen. Wählen Sie dann den LV Pressure als Eingangskanal aus und klicken Sie auf Auswahl, bevor Sie auf OK drücken. Klicken Sie nun auf Klassifikatoransicht, um alle Ausreißer des Herzzyklus zu entfernen, und auf Tabellenansicht, um die Tabellen für den Durchschnitt der maximalen dP/dt und minimalen dP/dt für den ausgewählten Zeitraum zu generieren. Wenn das Mäuseherz vor der Perfusion für null Stunden im HTK-Puffer gelagert wurde, wurde ein höherer systolischer Druck für den LV im Vergleich zum RV aufgezeichnet. Darüber hinaus zeigte der LV im Vergleich zum Wohnmobil auch eine signifikant stärkere Muskelkontraktion sowie Entspannung.
Wenn jedoch eine Perfusion am Herzen durchgeführt wurde, nachdem es acht Stunden lang gekühlt gelagert wurde, zeigten sowohl das LV als auch das RV eine signifikante funktionelle Reduktion im Vergleich zum Stadium Null. Es wurde beobachtet, dass die Rückgänge beim LV im Vergleich zum RV stärker ausfielen. Die Kontraktion und Entspannung des LV nach achtstündiger Speicherung betrug 25,1 % bzw. 30,7 % der Funktion, die der Null-Stunden-Speicherung entspricht, während die RV 32,5 % bzw. 29,1 % der Funktion im Vergleich zur Null-Stunden-Baseline aufwies. Der Hinweis auf eine primäre Transplantatdysfunktion von LV nach längerer Lagerung war signifikanter als die von RV. Die Konservierungsqualität hängt maßgeblich von der Perfusion von HTK ab.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Perfusion konsistent ist, um verschiedene Behandlungen genau vergleichen zu können. Mit der präzisen Messung der Erhaltungsfunktion eines Spenderherzes kann diese Methode leicht angepasst werden, um Medikamente zu screenen, die die Herzfunktion des Spenders verbessern können, und dann mit einem heterotopen Transplantationsmodell weiter zu validieren.
