Unser Protokoll ist benutzerfreundlich. Mit dieser Technik kann jeder leicht Komponenten aus dem Blut isolieren. Verunreinigungen können minimiert und Materialien genau getrennt werden.
Mit der Automatisierung und der Etablierung dieses Protokolls können Forscher leicht krebsrelevante Substanzen mit hoher Reinheit erhalten, was für verschiedene nachgelagerte Studien hilfreich ist. Insbesondere wird erwartet, dass es wichtige Vorteile für die Endnutzerforschung bietet. Jay Jeong, ein leitender Forscher und stellvertretender Manager am Cancer Genomics Research Institute, wird ihr Verfahren demonstrieren.
Legen Sie zunächst die LBx 1-Kassette ein, indem Sie den Kassettentyp auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts auswählen. Drücken Sie die Pfeiltaste, um die Anzahl der Proben zu ändern. Öffnen Sie dann die Instrumentenklappe und setzen Sie alle zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein.
Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Run-Taste auf dem Touchscreen.
Das Gerät schließt die Ventile an den Kartuschen, was ca. 30 Sekunden dauert. Folgen Sie der Nachricht, um die Tür zu öffnen. Entfernen Sie das Stützrad, und entfernen Sie die mit dem Ventil verschlossene Kartusche aus der Kartuschenhalterung.
Pipettieren Sie maximal 10 Milliliter einer Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe. Nachdem Sie die Patronen in das Gerät eingesetzt haben, schließen Sie die Klappe des Instruments und drücken Sie die OK-Taste.
Plasma- und Buffy-Mäntel werden automatisch vom Vollblut getrennt, was etwa 30 Minuten dauert. Sobald das Plasma und der Buffy-Coat getrennt sind, erscheint eine Meldung auf dem Bildschirm mit einem Alarmton. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die Stopp-Taste drücken.
Öffnen Sie die Tür. Entfernen Sie die Patrone und legen Sie sie auf den Tisch. Gewinnen Sie drei Milliliter Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze.
Gewinnen Sie dann drei Milliliter des Buffy-Mantels aus dem Buffy-Mantel-Auslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze. Legen Sie als Nächstes die LBx 2-Kassette ein, indem Sie den Namen der Patrone auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts auswählen. Drücken Sie die Pfeiltaste, um die Anzahl der Proben zu ändern, und befolgen Sie das gleiche Verfahren wie bei der LBx 1-Kassette, um die Patrone in den Patronenhalter einzusetzen.
Drücken Sie nach dem Einsetzen der Patrone und dem Schließen der Klappe die Run-Taste auf dem Touchscreen. Befolgen Sie die oben gezeigte Vorgehensweise, um die mit dem Ventil geschlossene Kartusche aus dem Kartuschenhalter zu entfernen und auf den Tisch zu legen. Die Dichtegradientenlösung wird mit einer serologischen Pipette pipettiert.
Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Lösung. Dann pipettieren Sie die Vollblutprobe und injizieren Sie sie langsam in den Probeneinlass. Schließen Sie nach dem Einsetzen und Sichern der Patrone die Klappe, und drücken Sie die Taste OK.
Sobald das Plasma und PBMC automatisch vom Vollblut getrennt werden, erscheint eine Nachricht mit einem Alarmton. Öffnen Sie die Klappe und entfernen Sie die Patrone. Gewinnen Sie drei Milliliter Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze und gewinnen Sie dann drei Milliliter des PBMC aus dem PBMC-Auslass.
In ähnlicher Weise injizieren Sie bei der FAST-Auto-Kartusche nach dem Entfernen der ventilverschlossenen Kartusche aus dem Kartuschenhalter sechs Milliliter der PBS-Lösung in den PBS-Einlass der Kartusche. Dann pipettieren Sie drei Milliliter Vollblut oder Buffy-Coat, das aus LBx 1 oder PBMC-Probe aus LBx 2 gewonnen wurde, und injizieren Sie die Probe langsam in den Probeneinlass der Patrone. Nachdem Sie die Patrone eingesetzt und gesichert haben, schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK.
Sobald die automatische Anreicherung der CTCs abgeschlossen ist, stoppen Sie den Alarm. Entfernen Sie die Patrone und setzen Sie den Backplate-Entferner (BPR) in die vier Löcher an der Vorderseite der Patrone ein. Drücken Sie den dunkelblauen Flügel mit den Daumen beider Hände und drücken Sie dann auf den hellblauen Körper, bis er klickt.
Entfernen Sie vorsichtig das Kartuschengehäuse, indem Sie es anheben. Nehmen Sie die Filtermembran mit einer Pinzette ganz vorsichtig am Rand auf und legen Sie die Membran zur Nukleinsäurepräparation in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen oder für die Färbung auf ein Objektträgerglas. Falls erforderlich, das gefilterte Blut mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in den Blutauslass zurückgewinnen.
Die extrahierten cfDNAs wurden mit einem Bioanalysator ausgewertet, und cfDNA-Screen-Bänder wurden zusammen mit einer elektronischen Leiter verwendet. Die grüne Linie wurde verwendet, um die Leiter und die Probe auszurichten. Die Dreiecksmarkierungen zeigen die DNA-Bande an.
Die meisten cfDNA haben eine Länge von 166 Basenpaaren und einige existieren in ganzzahligen Vielfachen der Länge. In der Regel misst die Konzentration von cfDNA bis zu einer Größe von 50 bis 700 Basenpaaren. Obwohl es einen Unterschied in der Menge gibt, die aus jeder einzelnen Probe gewonnen wird, wie 8,47 Nanogramm pro Milliliter und 5,2 Nanogramm pro Milliliter, waren die Ergebnisse der cfDNA-Extraktion in allen Fällen sowohl für die Konzentration als auch für die Größenverteilung gut.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die LBx-1-Methode cfDNA-haltiges Plasma genau separiert. Bei FAST-auto wurde die Membran entfernt und mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt, um CTCs und weiße Blutkörperchen nachzuweisen. Die gefärbte Membran, die auf Objektträgern platziert wurde, wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
Nach der Membranfärbung zeigen die Zellen DAPI- oder nuklear-positive Signale in blau, während EpCAM und CK- oder CTC-positive in grün und CD45- oder WBC-positive in rot hervorgehoben sind. Es ist nicht schwer, die Membran zu entfernen. Es ist jedoch notwendig, auf den Verlust und die Kontamination von CTCs zu achten.
Vollblut, PBMC und Buffy Coat sind alle verfügbar. Stattdessen müssen Sie nur die gesamte Lautstärke einstellen. Es können auch andere Flüssigkeiten verwendet werden, obwohl Tests erforderlich sind.
Diese Technik kann direkt in Krankenhäusern betrieben werden und die Substanz kann schnell gewonnen werden.
