Die Mikro-CT ist ein sehr verbreiteter Ansatz zur Quantifizierung der 3D-Morphologie und -Qualität von Knochen. Obwohl Analyseprotokolle zur Charakterisierung intakter kortikaler und trabekulärer Knochen ziemlich etabliert sind, gibt es einen geringeren Konsens über das Protokoll zur Analyse der Frakturheilung. Diese Technik umfasst eine nicht-invasive Bildgebung und eine genaue, kalibrierte 3D-Analyse mit einer guten Balance zwischen manuellen und automatisierten Techniken.
Es verwendet auch eine ausgeklügelte und flexible Softwareumgebung. Das Verfahren wird von Hwabok Wee, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst eine speziell entwickelte 3D-gedruckte Scanvorrichtung oder ähnliches, die ein Miniatur-Hydroxylapatit-Phantom zur Kalibrierung der Knochenmineraldichte enthält.
Legen Sie bis zu sechs lange Knochenproben in die Vorrichtung, um mehrere Proben gleichzeitig zu scannen. Platzieren Sie die vorbereitete Vorrichtung in einer Spritze oder einem konischen Röhrchen, das dem Durchmesser des Scanfeldes entspricht. Füllen Sie die Spritze mit einem Konservierungsmittel, z. B. Kochsalzlösung, um zu verhindern, dass die Proben während des Scanvorgangs austrocknen.
Nachdem Sie die Kalibrierung des Mikro-CT-Geräts bestätigt haben, richten Sie die Mittellinie der Probenvorrichtung an der ungefähren Mittellinie des Mikro-CTs aus, um sicherzustellen, dass sich die Proben innerhalb des Sichtfelds befinden und ihre langen Achsen ungefähr mit der axialen Richtung der resultierenden Bilder übereinstimmen. Stellen Sie als Nächstes die Scanparameter des Mikro-CT-Systems ein, indem Sie die Energie oder Intensität auf 55 Kilospannungsspitze, den Strom auf 145 Mikroampere, die isotrope Voxelgröße auf 10,5 Mikrometer und die Integrationszeit auf 300 Millisekunden einstellen. Untersuchen Sie dann die Scout-Bilder visuell in verschiedenen Ansichten, um das gesamte Volumen aller Hornhautproben abzudecken.
Starten Sie die Scan-Aufnahme und konvertieren Sie die Bilder nach Abschluss in einen DICOM-Stack, um sie in die Analysesoftware zu importieren. Um mit dem Zuschneiden von Bildern zu beginnen, wählen Sie jeweils ein Sample aus und schneiden Sie jeden Bildstapel zu, um sicherzustellen, dass das gesamte Sample im zugeschnittenen Volume enthalten ist. Speichern Sie das zugeschnittene Bild, indem Sie oben links auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Datei klicken, Projekt speichern unter und dann Projektgröße minimieren auswählen.
Um das Bild zu entrauschen, klicken Sie auf die Registerkarte Datei und wählen Sie das Bild aus, das mit "Daten öffnen" verarbeitet werden soll, wodurch das Bild im Fenster "Projektansicht" in der oberen linken Ecke des Bildschirms geöffnet wird. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Bildverarbeitung auszuwählen, gefolgt von Sandbox filtern, und klicken Sie dann auf Erstellen. Wählen Sie im Eigenschaftenfenster in der linken unteren Ecke des Bildschirms Daten als Vorschautyp aus.
Wählen Sie den Filtertyp aus dem Dropdown-Menü neben Filter aus und wählen Sie 3D für die Interpretation. Lassen Sie Separable als Kernel-Typ im Dropdown-Menü und geben Sie die Werte der Standardabweichung und des Kernelgrößenfaktors in das verfügbare leere Feld ein. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü neben der Ausgabe die Option Wie Eingabe aus.
Klicken Sie abschließend auf Übernehmen. Bei falsch ausgerichteten Proben kann der Benutzer eine Bildneuausrichtung durchführen, indem er ein 3D-gerendertes Bild der Probe erstellt, indem er das gefilterte, zugeschnittene Bild aus dem Projektansichtsfenster auswählt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Anzeige und dann Lautstärke-Rendering aus dem Dropdown-Menü auszuwählen.
Klicken Sie dann auf Erstellen, um das 3D-gerenderte Bild in der sagittalen und frontalen Ebene visuell zu überprüfen. Drehen Sie dann das gerenderte Volumen manuell, um eine gute Ausrichtung in der Längsachse zu erhalten. Um die Transformation auf die gedrehten Bilder anzuwenden, klicken Sie im Eigenschaftenfenster auf den Transformations-Editor.
Gehen Sie dann zu Transform Editor Manipulator und wählen Sie Transformer aus dem Dropdown-Menü. Drehen Sie das Bild, richten Sie es bei Bedarf neu aus, und klicken Sie dann erneut auf den Transformations-Editor, um das Bild zu sperren. Um als Nächstes neue Bildsegmente in der Querebene zu erstellen, erstellen Sie das gefilterte Bild neu, indem Sie das Bild im Fenster "Projektansicht" auswählen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Geometrietransformation auszuwählen, gefolgt von Transformiertes Bild neu berechnen aus dem Dropdown-Menü, und klicken Sie dann auf Erstellen. Wechseln Sie im Eigenschaftenfenster zu Daten, und wählen Sie im Dropdown-Menü Standard für die Interpolation aus, wählen Sie Erweitert für den Modus und Voxelgröße für beibehalten aus. Geben Sie Null in das verfügbare leere Feld für den Auffüllwert ein, und klicken Sie abschließend auf Übernehmen.
Um das interessierende Volumen zu definieren, gehen Sie die transversalen Bildschichten durch, identifizieren Sie die Mittelebene des Frakturkallus und definieren Sie sie basierend auf der proximalen und distalen Linse des Kallus. Wenn die Hornhautenden schwer zu spezifizieren sind, definieren Sie das Volumen basierend auf einem standardisierten Abstand von der Kallusmittelebene. Um die äußere Begrenzung des Kallus nach dem Zusammensetzen der transformierten Bilder zu segmentieren, klicken Sie auf die Registerkarte Segmentierung in der zweiten Registerkartenzeile am oberen Bildschirmrand.
Wählen Sie im Fenster des Segmentierungseditors das transformierte Bild aus dem Dropdown-Menü neben dem Bild aus. Doppelklicken Sie im Fenster MATERIALIEN auf Hinzufügen. Auf diese Weise werden zwei Registerkarten mit den Namen Material3 und Material4 angezeigt.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Material3 in Hornhaut und Material4 in kortikalen Knochen umzubenennen. Klicken Sie anschließend im Fenster AUSWAHL auf das Lasso-Symbol. Wählen Sie aus den angezeigten Optionen Freihand für den 2D-Modus, Innen für den 3D-Modus und sowohl Automatisch nachzeichnen als auch Kanten nachzeichnen als Optionen aus.
Markieren Sie dann mit dem Lasso die äußere Grenze der Hornhaut. Wiederholen Sie die Konturierungsschritte mit Schichten, die über das gewünschte Volumen abgetastet werden, und die Schichten können z. B. um 20 Schichten voneinander entfernt sein. Um ein vollständiges Kallusetikett zu erstellen, wählen Sie im Fenster MATERIALIEN die Kallusdatei aus, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Auswahl und wählen Sie Interpolieren aus dem Dropdown-Menü.
Klicken Sie dann im Auswahlfenster auf das Pluszeichen. Als nächstes segmentieren Sie den kortikalen Knochen, einschließlich der Markhöhle. Interpolieren Sie dann die konturierte Oberfläche des periostalen Kortex, um eine kortikale Knochenmarkierung zu erstellen, wie es zuvor für den Kallus durchgeführt wurde.
Um das konturierte Volumen und den mittleren Grauwert der Hornhaut zu berechnen, klicken Sie auf die Registerkarte Segmentierung in der oberen Zeile des Bildschirms und wählen Sie Materialstatistik aus dem Dropdown-Menü, um eine Tabelle mit berechneten Werten zu erstellen. Beachten Sie, dass die Werte des kortikalen Knochens und des Kallus nach Subtraktion des kortikalen Knochens separat angegeben werden. Exportieren Sie die generierte Tabelle und speichern Sie die Daten, indem Sie auf In Workspace exportieren klicken.
Um die Graustufeneinheiten in die Knochenmineraldichte umzuwandeln, schneiden Sie das 3D-Bild des 4,5-Millimeter-HA-Phantoms aus dem gesamten Bild zu und klicken Sie auf Segmentierung. Um Kreise am ersten und letzten Segment zu zeichnen, klicken Sie im Fenster MATERIALIEN viermal auf Hinzufügen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um Material3, 4, 5 und 6 in Phantom1, 2, 3 bzw. 4 umzubenennen.
Wählen Sie als Nächstes Phantom1 aus. Klicken Sie auf das Pinselsymbol im Auswahlfenster und verwenden Sie den Schieberegler, um die Pinselgröße so anzupassen, dass die Größe des Kreises kleiner ist als die des Phantoms. Um ein Volumen für jeden HA-Zylinder zu erstellen, wenden Sie die Interpolation an, indem Sie Phantom1 im Fenster MATERIALIEN auswählen, auf die Registerkarte Auswahl in der oberen Zeile des Bildschirms klicken und im Dropdown-Menü Interpolieren auswählen.
Klicken Sie dann im Fenster AUSWAHL auf das Pluszeichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen HA-Zylindern. Verwenden Sie die generierten 3D-Beschriftungen, um die mittleren Grauwerte der vier analysierten HA-Zylinder zu berechnen.
Zeichnen Sie die mittleren Grauwerte und die entsprechenden Knochenmineraldichtewerte (BMD) auf, die vom Phantomhersteller bereitgestellt werden. Generieren Sie eine Korrelationsgleichung zwischen BMD und den Grauwerten mithilfe der linearen Regression. Um die mineralisierte Hornhaut zu segmentieren, klicken Sie im Fenster MATERIALIEN auf Hinzufügen.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um das neue Material in Kallusmineralisiert umzubenennen. Wählen Sie als Nächstes Callus im Fenster MATERIALIEN aus, gefolgt von einem Klick auf Auswählen. Klicken Sie dann im Fenster AUSWAHL auf Schwellenwert.
Wählen Sie den niedrigeren Wert aus und wenden Sie den berechneten Schwellenwert aus dem HA-Phantom in der Schwellenwertmaskierung an. Klicken Sie dann im Fenster AUSWAHL auf Nur aktuelles Material auswählen, gefolgt von einem Klick auf Maskierte Voxel auswählen. Wählen Sie dann im Fenster MATERIALIEN die Option Kallusmineralisiert aus und klicken Sie auf das Pluszeichen im Fenster AUSWAHL.
Klicken Sie abschließend im Fenster MATERIALIEN auf 3D von Kallusmineralisierung. Die Mikro-CT-Bilder, die zu drei Zeitpunkten analysiert wurden, zeigten die erhebliche Bildung von mineralisiertem Kallus an Tag 14. Es wurde eine schrittweise Zunahme des Knochenfraktionsvolumens und der Knochenmineraldichte beobachtet, während die Heilung von Tag 14 bis Tag 21 und 28 voranschritt, was mit einer knöchernen Überbrückung der Frakturlücke übereinstimmte.
Wie erwartet, durchlief der Kallus zwischen dem 21. und 28. Tag eine Resorption oder einen Umbau, was sich in einem Rückgang des Gesamtkallusvolumens zeigte. Die kortikale Überbrückung des Kallus war am 28. Tag deutlicher als zu jedem früheren Zeitpunkt. Bei komplexen Frakturen empfehlen wir, die resultierende halbautomatische Segmentierung sorgfältig zu überprüfen, indem Sie durch alle Bildschichten, manchmal in verschiedenen Ebenen, scrollen und bei Bedarf Konturen anpassen.
Sobald der Kallus der Fraktur genau segmentiert ist, können zusätzlich zu den in diesem Protokoll berichteten Ergebnisparametern mit zusätzlichen Skripten berechnet werden. Dazu gehören zum Beispiel Trägheitsmomente und Konnektivitätsdichte.
