Das Protokoll reduziert signifikant die mitochondriale DNA-Kopienzahl in der Eizelle. Das könnte für das Klonen innerhalb der Spezies von Vorteil sein. Diese Methode reduziert die mitochondriale DNA-Kopienzahl in Rindereizellen um über 90%, was die Inzidenz von mitochondrialer Heteroplasmie in geklonten Embryonen reduzieren könnte.
Laura Adams, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Sammeln Sie zunächst mit einer Pipette die ausgewählten reifen Eizellen aus dem HSOF-Tropfen und legen Sie sie in das 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 50 Mikroliter der HSOF-CB-Lösung enthält. Zentrifen Sie die Eizellen bei 15.000 mal G für 12 Minuten.
Während die Eizellen zentrifugiert werden, bereiten Sie die Bisektionsplatte vor. Machen Sie dazu zunächst ein Muster auf dem Deckel einer 60 Millimeter Petrischale mit 20 Mikrolitern pro Tropfen und bedecken Sie die Tropfen vollständig mit Mineralöl. Markieren Sie mit einem dünnen Marker die Linien unter der Schale.
Decken Sie die Schale mit einem undurchsichtigen Deckel ab, bis die Zentrifugation abgeschlossen ist, um Osmolaritätsänderungen von Mikrotropfen zu verhindern. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Eizellen in der Lösung zu sammeln, und bewegen Sie sie in einen leeren Teil eines neuen Suchfeldes mit vier 400-Mikroliter-HSOF-Tropfen, bevor Sie die Eizellen durch HSOF-Tropfen waschen. Schalten Sie die Heizstufe auf 38,5 Grad Celsius ein.
Verwenden Sie eine Mundpipette, um die zentrifugierten Eizellen vom HSOF-Tropfen zum oberen linken T2-Tropfen der Bisektionsplatte zu bewegen. Dann waschen Sie die Eizellen durch die nächsten drei Tropfen in der obersten Reihe. Deponieren Sie die Eizellen in einem der Nasentropfen und stellen Sie sicher, dass es wenig bis gar keinen Kontakt zwischen ihnen gibt.
Beobachten Sie die Eizellen, bis es zu einer deutlichen Verformung der zonae pellucidae kommt. Sobald eine einzelne Eizelle zona pellucida deformiert ist, bewegen Sie diese Eizelle in den benachbarten T2-Tropfen. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn sich zusätzliche Eizellen verformen, bis alle Eizellen aus der Pronase entfernt und in den T2-Tropfen gelegt wurden.
Beobachten Sie die Eizellen, bis nur noch eine dünne Schicht der Zona pellucida übrig ist. Waschen Sie die Eizellen durch die nächsten drei Tropfen innerhalb der Reihe und legen Sie sie dann in vertikalen Linien innerhalb der CBT20-Tropfen ab. Beginnen Sie mit weniger Eizellen in den vertikalen Linien und erhöhen Sie die Anzahl der Eizellen pro Tropfen, wenn die Bisektionsfähigkeiten fortschreiten.
Konzentrieren Sie sich auf den ersten, CBT20-Tropfen ganz links, der Eizellen enthält, und verwenden Sie eine Mundpipette, um die Eizellen so zu drehen, dass der mitochondriendichte Teil jeder Eizelle entweder zum Arm des Mikroskops zeigt oder vom Arm des Mikroskops weg ist. Legen Sie die Spitze der Mikroklinge links von der obersten Eizelle ab, in Übereinstimmung mit dem Raum direkt über dem mitochondriendichten Teil. Halten Sie die Spitze der Klinge an der gleichen Stelle und senken Sie die Klinge vorsichtig ab, um den ganzen Weg durch die Eizelle zu schneiden.
Stellen Sie sicher, dass der mitochondriendichte Ooplast und der mitochondrienreduzierte Ooplast ungefähr die gleiche Größe haben und sich die Klinge im klarsten Segment der zentrifugierten Eizelle halbiert. Stellen Sie beim Anheben der Klinge sicher, dass die gleiche Linie beibehalten wird und dass die Spitze der Klinge an derselben Stelle verbleibt, und heben Sie dann die Spitze vorsichtig von der Platte an. Wiederholen Sie die Bisektionsschritte für alle Eizellen innerhalb des ersten Bisektionstropfens.
Wenn Eizellen in zusätzlichen Tropfen vorhanden sind, orientieren und halbieren Sie die verbleibenden Eizellen. Sammeln Sie mit einer Mundpipette mitochondrienreduzierte Ooplasten aus dem ersten Bisektionstropfen. Legen Sie sie in den linken T20-Tropfen in der unteren Reihe der Platte.
Wiederholen Sie dies für alle verbleibenden Bisektionstropfen. Sammeln Sie mit einer Mundpipette mitochondriendichte Ooplasten aus dem ersten Bisektionstropfen. Legen Sie sie in den rechten T20-Tropfen in der unteren Reihe der Platte.
Wiederholen Sie dies für alle verbleibenden Bisektionstropfen. Holen Sie sich die T10-Viererschale aus dem Inkubator. Bewegen Sie mit einer Mundpipette alle mitochondrienreduzierten Ooplasten zum gut beschrifteten MR und die mitochondriendichten Ooplasten zum gut beschrifteten M.Legen Sie die Vier-Well-Platte zurück in den Kohlendioxid-kontrollierten Inkubator.
Lassen Sie die Ooplasten mindestens 30 Minuten ruhen, bevor Sie mtDNA quantifizieren. Für eine erfolgreiche Bisektion weisen die Proben von ganzen Eizellen und mitochondriendichten Ooplasten ähnliche CT-Werte auf. Die Proben von mitochondrienreduzierten Ooplasten haben im Vergleich zu den Proben aus den anderen beiden Gruppen höhere CT-Werte.
Bei einer erfolglosen Bisektion reduziert die Bisektion den mtDNA-Gehalt in den mitochondrienreduzierten Ooplasten nicht effektiv. Nach der Erstellung einer Standardkurve und der Verwendung der bereitgestellten mtDNA-Kopienzahlformeln wurde mit diesem Protokoll eine durchschnittliche mtDNA-Reduktion der Eizelle von 93,88% erreicht. Die richtige Ausrichtung jeder Eizelle im Bisektionstropfen, die präzise Halbierung jeder Eizelle und die genaue Sortierung der Ooplasten sind alles kritische Schritte, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Zwei Ooplasten können mit einer somatischen Zelle verschmolzen werden. Die verschmolzenen Drillinge können dann chemisch aktiviert und als rekonstruierte Embryonen kultiviert werden.
