Diese Studie wurde durch das Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) und das Teaching Reform Research Project der China Pharmaceutical University (2019XJYB18) unterstützt.

1. Aufbereitung des halbfesten Mediums
<ol><li>Traditioneller halbfester Agar
	<ol><li>Bereiten Sie den traditionellen halbfesten Agar gemäß der Rezeptur des bakteriellen Motilitätstestmediums unter Verwendung der Grundzutaten11 zu. 10 g Tryptose, 15 g NaCl, 4 g Agar in ausreichend destilliertem Wasser auflösen, den pH-Wert auf 7,2 ± 0,2 einstellen und das Endvolumen auf 1.000 ml auffüllen.</li>
		<li>Autoklavieren Sie den Agar bei 121 °C für 20 min und dosieren Sie ihn als 3 cm hohes halbfestes Medium in 10-ml-Reagenzgläser.</li>
	</ol></li>
	<li>Traditioneller halbfester Agar mit TTC
	<ol><li>Nach dem Autoklavieren des herkömmlichen halbfesten Mediums wird es auf 50 °C abgekühlt, 5 ml sterile 1%ige TTC-Lösung zu 100 ml Medium gegeben, gemischt und in 10 ml-Reagenzgläser dosiert, um ein 3 cm hohes halbfestes Medium zu bilden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bakterienstämme
ANMERKUNG: Achtzig Stämme wurden aus der aquatischen Umwelt isoliert und mit einem automatisierten Bakterienidentifikationsinstrument identifiziert (siehe Materialtabelle), darunter Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae und Aeromonas hydrophila (Tabelle 1). Staphylococcus aureus (siehe Materialtabelle) wurde als negative unbewegliche Kontrolle verwendet; Als Positivkontrollstämme wurden Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella typhimurium ( siehe Materialtabelle) verwendet.
<ol><li>Identifizieren Sie Testbakterienstämme, die für die Motilitätsanalyse verwendet werden sollen.</li>
	<li>Negative unbewegliche Kontrollen und bewegliche Positivkontrollstämme einschließen.</li>
</ol>3. TTC-verstärkte Beobachtung der bakteriellen Motilität
<ol><li>Einzelne Kolonien von Testbakterien werden von Agarplatten entnommen und mit Impfnadeln in die beiden oben genannten halbfesten Medien (Schritte 1.1.2 und 1.2.1) geimpft.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Röhrchen bei 37 °C im Inkubator für 24-48 h, um die Ergebnisse zu beobachten.</li>
	<li>Beobachten Sie den Wachstumszustand: Charakterisieren Sie die Bakterien als unbeweglich (-), wenn nur die Einstichlinie rot ist. Charakterisieren Sie die Bakterien als beweglich (+), wenn sich die rote Farbe entlang der Einstichlinie12 leicht nach außen ausbreitet.</li>
</ol>4. Einfluss unterschiedlicher Agarkonzentrationen auf die bakterielle Motilität
<ol><li>Bereiten Sie halbfeste Medien mit 0,3 %, 0,5 % und 0,8 % Agar vor und beimpfen Sie sie wie oben beschrieben durch Punktion. Beobachten Sie die Ergebnisse nach 24-48 h Inkubation.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+motility.">Bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 27 (2), 165 (1934).</li><li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis.">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), 68-70 (2006).</li><li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review.">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), 417-422 (2009).</li><li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance.">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li><li>Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+arrangement+of+several+flagellins+within+bacterial+flagella+improves+motility+in+different+environments.">Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments.</a> Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).</li><li>Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+agar+concentration+on+the+growth+and+morphology+of+submerged+colonies+of+motile+and+non-motile+bacteria.">The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria.</a> Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).</li><li>Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+for+how+sigma+factor+AlgT+and+transcriptional+regulator+AmrZ+inhibit+twitching+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).</li><li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity,+bacterial+cell+size+and+capsule.">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Der Nachweis der bakteriellen Motilität durch die Methode des halbfesten Mediums wird von vielen Faktoren beeinflusst13,14. Bakterielle Wachstumsbedingungen, wie z. B. Sauerstoff (aerob auf der Agaroberfläche, nicht aerob am Boden des Röhrchens mit dem halbfesten Medium), pH-Wert und Temperatur, können die Lebensfähigkeit bakterieller Flagellen beeinträchtigen, was zu einer verminderten Motilität oder sogar zu einem Verlust der Motilität führen kann15. Darüber hinaus können einige schleimartige Bakterien als Motilität durch die Produktion von Podokonjugaten beeinträchtigt werden.
Die Zugabe von TTC zum halbfesten Medium hilft bei der Beobachtung der Motilität. Die fermentativen Bakterien mit Antriebskraft können nach der Inkubation entlang der Einstichlinie in alle Richtungen wachsen. Daher wird das Medium um die Einstichlinie herum rot. Die nichtfermentativen Bakterien mit Antriebskraft haben einen niedrigen Sauerstoffgehalt im unteren Teil des Mediums. Daher wachsen diese Bakterien schlecht, so dass nur die obere Schicht des Mediums rot ist. Bakterien ohne Antriebskraft können nur an der Impflinie wachsen, und nur die Einstichlinie erscheint rot. 
Beim Nachweis der bakteriellen Motilität mit TTC-halbfestem Medium sind die Ergebnisse umso offensichtlicher, je länger die Kulturzeit ist, insbesondere bei niedrigeren Agarkonzentrationen. Wenn das Ergebnis schwer zu interpretieren ist, sollte die Kulturzeit entsprechend verlängert werden. Dies kann mit der Agarkonzentration des halbfesten Mediums, der Anzahl der Bakterien und ihrer Motilitätzusammenhängen 16. Darüber hinaus zeigte diese Methode, dass einige Stämme von E. coli und P. aeruginosa auf herkömmlichem halbfestem Agarmedium nicht wachsen konnten und nur eine schwache rote Farbe auf der Oberfläche des Mediums auf halbfestem TTC-Agarmedium zeigten. Dies kann auf die Produktion von Kapseln durch solche Stämme zurückzuführen sein, die ihre Motilität beeinflusst17. Dieses Phänomen tritt aufgrund seiner Kapsel auch bei Neisseria meningitidis18 auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis der bakteriellen Motilität mit einem chromogenen halbfesten Medium, das TTC enthält, den Einfluss bakterieller Faktoren auf die Testergebnisse reduziert und die Ergebnisse mit bloßem Auge leichter zu beobachten macht. Der Vorteil einer hohen Nachweisrate macht diese Methode zu einer effektiven Methode, die das herkömmliche halbfeste Medium zum Nachweis der bakteriellen Motilität ersetzen kann.

Die bakterielle Motilität spielt eine entscheidende Rolle bei der bakteriellen Pathogenität, der Biofilmbildung und der Arzneimittelresistenz1. Die bakterielle Motilität ist eng mit der Pathogenität verbunden und ist für die bakterielle Besiedlung während der frühen Infektion von Wirtszellen notwendig2. Die Bildung von Biofilmen steht in engem Zusammenhang mit der bakteriellen Motilität, bei der Bakterien durch Motilität an der Oberfläche fester Medien haften. Es wurde lange angenommen, dass die bakterielle Motilität positiv mit der Biofilmbildung korreliert. Ein hohes Maß an bakterieller Arzneimittelresistenz aufgrund von Biofilmen kann zu anhaltenden Infektionen führen, die eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen 3,4,5. Daher ist es wichtig, die bakterielle Motilität nachzuweisen. Der bakterielle Motilitätstest wird hauptsächlich verwendet, um die Motilität verschiedener Bakterienformen im lebenden Zustand zu untersuchen, die indirekt das Vorhandensein oder Fehlen von Flagellen bestimmen können und somit eine wichtige Rolle bei der Identifizierung von Bakterien spielen.
Es gibt direkte und indirekte Methoden zum Nachweis der bakteriellen Motilität6. Da Bakterien mit Geißeln Motilität aufweisen, ist es möglich, indirekt festzustellen, ob Bakterien beweglich sind, indem das Vorhandensein oder Fehlen von Geißeln nachgewiesen wird. So ist es beispielsweise möglich, die Motilität indirekt durch Elektronenmikroskopie und Flagellenfärbung nachzuweisen, um anzuzeigen, dass Bakterien beweglich sind. Es ist auch möglich, durch direkte Methoden zu detektieren, wie z. B. Suspensionstropfen und halbfeste Punktionsmethoden. 
Die halbfeste Punktionsmethode, die üblicherweise in mikrobiologischen Labors verwendet wird, um die bakterielle Motilität nachzuweisen, impft die Bakterien in das Einstichmedium des halbfesten Agars, das 0,4-0,8 % Agar enthält, je nach Richtung des Bakterienwachstums. Wenn die Bakterien entlang der Einstichlinie wachsen, um sich auszubreiten, erscheinen wolkenartige (bürstenartige) Wachstumsspuren, die auf das Vorhandensein von Geißeln und damit auf Motilität hinweisen. Wenn keine Wachstumsspuren an der Einstichlinie vorhanden sind, ist das Bakterium weder gegeißelt noch beweglich. 
Diese Methode hat jedoch ihre Nachteile: Die Bakterien sind farblos und durchsichtig, die Flagellenaktivität wird durch die physiologischen Eigenschaften der lebenden Bakterien und andere Faktoren sowie die Konzentration des Agars und den geringen Durchmesser des Reagenzglases beeinflusst. Darüber hinaus sind aerobe Bakterien nur für das Wachstum auf der Agaroberfläche geeignet, was die Beobachtung der bakteriellen Motilität beeinträchtigt. Um dieses Experiment zu verbessern, wurde dem Medium daher 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (farblos) zugesetzt, um eine zuverlässigere und intuitivere Methode zur Bestimmung der bakteriellen Motilität zu etablieren als die derzeitige direkte Punktionsmethode, bei der intrazelluläre Dehydrogenasen verwendet werden, um die Bildung eines roten Produkts von TTC 7,8,9,10 zu katalysieren.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>Positive control</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>Positive control</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella typhimurium&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>Positive control</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>Negative nonmotile control</td></tr><tr><td>Tryptose</td><td>&amp;nbsp;OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 automated microbial identification system</td><td>Bio M&amp;eacute;rieux</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing bacterial motility based on a color reaction

Die bakterielle Motilität ist entscheidend für die bakterielle Pathogenität, die Biofilmbildung und die Arzneimittelresistenz. Die bakterielle Motilität ist entscheidend für die Invasion und/oder Verbreitung vieler pathogener Spezies. Daher ist es wichtig, die bakterielle Motilität nachzuweisen. Bakterienwachstumsbedingungen wie Sauerstoff, pH-Wert und Temperatur können das Bakterienwachstum und die Expression von bakteriellen Flagellen beeinflussen. Dies kann zu einer verminderten Motilität oder sogar zu einem Verlust der Motilität führen, was zu einer ungenauen Bewertung der bakteriellen Motilität führt. Basierend auf der Farbreaktion von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) durch intrazelluläre Dehydrogenasen lebender Bakterien wurde TTC zu herkömmlichem halbfestem Agar zum Nachweis der bakteriellen Motilität hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese TTC-Methode mit halbfestem Agar zum Nachweis der bakteriellen Motilität einfach und leicht zu bedienen ist und keine großen und teuren Instrumente erfordert. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die höchste Motilität in halbfestem Medium beobachtet wurde, das mit 0,3%igem Agar hergestellt wurde. Im Vergleich zum herkömmlichen halbfesten Medium sind die Ergebnisse einfacher auszuwerten und genauer.

Sowohl Standardstämme als auch isolierte Stämme wurden zur Motilitätsdetektion verglichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Aufgrund des Fehlens von Flagellen wuchsen Staphylococcus aureus und Klebsiella pneumoniae nur entlang der inokulierten Linie sowohl auf traditionellen als auch auf halbfesten TTC-Medien. Im Gegensatz dazu zeigten Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Salmonella typhimurium nach 24-stündiger Kultivierung auf halbfestem TTC-Medium ein Wachstum in alle Richtungen um die inokulierte Linie herum. Dies war nach 48-stündiger Kultur noch deutlicher (Abbildung 1). Obwohl die Bakterien im traditionellen halbfesten Medium in alle Richtungen wuchsen, war es aufgrund der geringen Anzahl von Bakterien an der Außenseite der inokulierten Linie viel schwieriger zu visualisieren als im TTC-Medium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63706/63706fig01.jpg"> Abbildung 1: Ergebnisse des Motilitätstests mit halbfestem TTC-Medium. links Staphylococcus aureus, rechts Escherichia coli. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/63706/63706fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2">Dehnung</td>
			<td colspan="2">Halbfestes Medium mit 0,4 % Agar</td>
			<td colspan="2">Halbfestes Medium mit 0,4 % Agar und 0,005 % TTC</td>
		</tr><tr><td>24 h</td>
			<td>48 h</td>
			<td>24 h</td>
			<td>48 h</td>
		</tr><tr><td colspan="2">P. aeruginosa ATCC27853</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td colspan="2">E. coli ATCC25922</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td colspan="2">S. typhimurium ATCC14028</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td colspan="2">S. aureus ATCC25923</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td colspan="2">E. coli (15)</td>
			<td>12</td>
			<td>14</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Salmonella spp. (8)</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">A. hydrophila (20)</td>
			<td>18</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vibrio spp. (8)</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">P. aeruginosa (24)</td>
			<td>18</td>
			<td>20</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td colspan="2">K. pneumoniae (5)</td>
			<td>-5</td>
			<td>-5</td>
			<td>-5</td>
			<td>-5</td>
		</tr><tr><td colspan="6">Die Zahlen geben die Anzahl der positiven Stämme (+) und der negativen Flecken (-) an.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Vergleich der bakteriellen Motilität. 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63706/63706fig02.jpg"> Abbildung 2: Beobachtung der Motilitätsaktivität von Escherichia coli bei unterschiedlichen Agarkonzentrationen. Von links nach rechts: 0,3 %, 0,5 %, 0,8 % Agar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/63706/63706fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Der Einfluss der Agarkonzentration auf die bakterielle Motilität ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir fanden heraus, dass die höchste Motilität in halbfestem Medium beobachtet wurde, das mit 0,3% Agar hergestellt wurde. Die mittlere Farbe in der Röhre färbte sich fast vollständig rot. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Bereich der roten Diffusion und die Diffusion verlängerte sich mit zunehmender Agarkonzentration.

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Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion vor. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfacher auszuwerten und genauer ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

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A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Forschung

Biologie

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochemie

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Biotechnik

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Immunologie und Infektion

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Bacterial Co-Incubation Assay: A Fluorescence Microscopy-Based Technique to Visualize Intraspecific Bacterial Competition at the Single-Cell Level

Source: Smith, S., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62851">Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a fluorescence microscopy-based method to study bacterial competition at the single-cell level. This method provides insights into the structure and function of bacterial communities.

Bakterieller Co-Inkubations-Assay: Eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der intraspezifischen bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene