Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die hepatische Glukoseproduktion in einem polyzystischen Ovarialsyndrom oder PCOS-Mausmodell zu bestimmen. Der fehlregulierte Glukosestoffwechsel ist eine wichtige Manifestation von PCOS und der Schlüssel zu seiner Pathogenese. Daher sind Studien zur Bewertung des Glukosestoffwechsels bei PCOS von größter Bedeutung.
In dieser Studie diskutieren wir Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Quantifizierung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell durch Messung des M plus zwei Anreicherungen von sechs sechs deuterierten Glukosen, einem stabilen Isotopenglukose-Tracer, mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder GCMS. Dieses Verfahren beinhaltet die Schaffung einer stabilen isotopenförmigen Glucose-Tracer-Lösung, die Verwendung der Platzierung des Schwanzvenenkatheters und die Infusion des Glucose-Tracers sowohl im nüchternen als auch im glucosereichen Zustand in derselben Maus im Tandem. Bereiten Sie einen Tag vor dem Eingriff den stabilen Isotopenglukose-Tracer in normaler Kochsalzlösung vor.
Für dieses Experiment wurde die Glukoseproduktion während des Fastens unter glukosereichen Bedingungen gemessen, so dass das Glukoseisotop in zwei verschiedenen Präparaten hergestellt wurde. Der Tracer wurde unter sterilen Bedingungen hergestellt, indem sterile und pyrogenfreie sechs sechs deuterierte Glukose und sterile 0,9% Natriumchloridlösung mit oder ohne Glukose gelöst wurden. Das erste Infusat wurde nur mit dem Tracer hergestellt.
Das zweite Infusat enthielt sowohl den Tracer als auch die nichtisotopische Glukose. Sobald die Lösungen hergestellt waren, wurden sie mit dem 0,22-Mikron-Filter steril filtriert und bei vier Grad Celsius gelagert. Die Lösungen wurden so hergestellt, dass die endgültige Infusionsdosis nahe einem Milligramm pro Kilogramm und Minute bzw. zwei Milligramm pro Kilogramm und Minute lag.
Für die Messung der Glukoseerscheinungsrate während des basalen Zustands im glukosereichen Zustand wurde eine grundierte durchschnittliche Infusion mit konstanter Rate von sechs sechs deuterierten Glukosen bei 1,08 Milligramm pro Kilogramm und Minute bzw. 1,9 Milligramm pro Kilogramm in Minute verwendet. Um den gefütterten Zustand nachzuahmen, verwendeten wir eine durchschnittliche D-Glucose-Infusionsrate von 18,8 Milligramm pro Kilogramm und Minute während eines glukosereichen Zustands. Entfernen Sie die Mäuse aus ihren Heimkäfigen und legen Sie sie drei Stunden vor Beginn des Experiments in ihre Fastenkäfige.
Für dieses Experiment verwendeten wir vier Monate alte weibliche Mäuse aus dem Stamm C57BL6J. Stellen Sie die Käfigausrüstung zusammen, indem Sie die Mäuse in eine bestimmte Anzahl von Mäusen pro Insulinpumpe gruppieren. Platzieren Sie Trennwände auf einer flachen, stabilen Basis, um individuelle Ställe für die Mäuse zu schaffen.
Die Käfige sind klar und bestehen aus Plexiglas. Es gibt eine flache, stabile Basis, auf der die Trennwände sitzen. Die Tür zum Käfig gleitet zum Schließen und hat eine Kerbe an der Unterseite, damit der Schwanz durchpassen kann.
Montieren Sie die Spritzen mit einem Milliliter Basalinfusat und verbinden Sie sie dann mit dem Polyethylenschlauch mit dem Infusionspumpenschlauch. Bereiten Sie die Infusionspumpe vor, indem Sie die Rate auf 150 Mikroliter pro Stunde einstellen, was der Basalrate entspricht. Ein Wasserbad auf 48 Grad Celsius erhitzen.
Bereiten Sie die Kathetereinführungsstation neben dem Wasserbad vor, die die 30-Gauge-Halbzoll-Nadeln, den Silastikschlauch und das ein Zoll große, durchsichtige Transportband enthält. Wählen Sie eine Maus aus und legen Sie sie in eine sichere Halterung mit Zugriff auf den Schwanz. Legen Sie ein Stück Klebeband über den proximalen Teil des Schwanzes, um Platz für die Kathetereinführung zu schaffen.
Bringen Sie die Maus zum Wasserbad und führen Sie den Schwanz für ca. 30 bis 45 Sekunden in das Wasserbad ein. Dies hilft, das Schwanzgefäßsystem für die Katheterplatzierung zu erweitern. Die Kathetereinführung muss unter sterilen Bedingungen erfolgen.
Sobald der Schwanz erwärmt ist, reinigen Sie den Schwanz und platzieren Sie eine kleine zahnlose Alligatorklemme aus Kupfer als Tourniquet am proximalen Ende des Schwanzes. Visualisieren Sie die laterale Schwanzvene unter einer Lupe. Führen Sie dann den Katheter vorsichtig in die Schwanzvene ein und spülen Sie die Lösung vorsichtig, um die Durchgängigkeit des Katheters sicherzustellen.
Wickeln Sie ein Stück Transportband um die Einführstelle, um den Katheter zu sichern, und entfernen Sie das kleine Tourniquet vom Schwanz. Legen Sie die Maus in ihren individuellen Käfig und schließen Sie die Schiebetür, um sicherzustellen, dass der Schwanz durch die Kerbe herausragt und außerhalb des Käfigs bleibt. Legen Sie ein zusätzliches Stück Klebeband über den gesamten Katheter und den Schwanz, um es an der Grundplatte des Käfigs zu befestigen.
Trennen Sie die Spülung vom Schwanzvenenkatheter und legen Sie die kleine Klemme auf den silastischen Schlauch des Katheters, um einen Rückfluss zu verhindern, während Sie die Infusatleitung von der Pumpe verbinden. Entfernen Sie nach dem sicheren Anschluss die Klemme und spülen Sie die Ansauglösung, die aus dem Infusat besteht. Stellen Sie sicher, dass die Lösung im Röhrchen klar und nicht blutbefleckt ist.
Sobald festgestellt wird, dass die Infusionsleitungen ordnungsgemäß funktionieren, entfernen Sie die Abdeckung von der Maus. Legen Sie die Standardbettwäsche um die Maus herum. Beginnen Sie die Infusion mit dem Infusat, das den Tracer enthält, und lassen Sie ihn drei Stunden lang kontinuierlich laufen.
Überprüfen Sie für die Dauer der Infusion weiterhin das Wohlbefinden der Mäuse sowie die Infusionsleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Infusionsschlauch ordnungsgemäß gesichert ist und dass keine Lecks von den Leitungsanschlusspunkten vorhanden sind. Nachdem die erste Infusion abgeschlossen ist, stoppen Sie die Infusion und legen Sie eine Klemme auf den Schlauch des Katheters, um einen Rückfluss zu verhindern.
Entfernte die Mäuse vorsichtig aus ihren Gehegen, ohne den Katheter zu stören, um Blut zu sammeln. Für dieses Experiment unterzogen sich die Mäuse einer Wangenvenenpunktion mit einer vier Millimeter langen Lanzette. Sammeln Sie ca. 75 Mikroliter Blut in Ihre gewünschte Durchstechflasche.
Um Proben in Vorbereitung auf die Massenspektrometrie zu deproteinisieren, fügen Sie etwa 15 Mikroliter Blut zu 500 Mikroliter Aceton hinzu. Verbleibendes Blut kann verwendet werden, um den Blutzuckerspiegel über ein Glucometer und/oder eine Zentrifuge zur Trennung des Plasmas für zukünftige Hormonassays zu überprüfen. Entfernen Sie das Infusat aus den Spritzenpumpen, indem Sie den Schlauch von den Spritzen trennen, und ersetzen Sie ihn durch das zweite Infusat, das Tracer zusammen mit Glukose enthält.
Wiederholen Sie die vorherigen Infusionsschritte mit der glukosereichen Isotopenglukoseinfusion. Um einen stationären Zustand zu erreichen, lassen Sie einen Bolus der sekundeinfusat mit 600 Mikroliter pro Stunde für 15 Minuten laufen. Notieren Sie sich die Startzeit für jede Gruppe von Käfigen.
Verringern Sie die Infusionsrate auf 150 Mikroliter pro Stunde, um die drei Stunden Gesamtinfusionszeit zu vervollständigen. Wiederholen Sie die Blutentnahme wie zuvor beschrieben. Trennen Sie die Infusionen, üben Sie Druck auf die Katheterstellen aus, bis die Blutung aufhört, und bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück.
Als nächstes werden die Proben für GCMS gesendet. Berechnen Sie die Isotopenanreicherung des Glucoseisotops unter Glucose Peak durch GCCMS unter Verwendung des Pentaacetatderivats. Kurz gesagt, diese Methode beinhaltet die Herstellung des Pentaacetatderivats von Glucose, gefolgt von einer Probenanalyse unter Verwendung von GCMS im positiven chemischen Ionisationsmodus.
Eine selektive Ionenüberwachung des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 171 zu 169 wird durchgeführt, um das M plus zwei Anreicherungen des Glukoseisotops zu bestimmen. Alle kinetischen Messungen werden unter der Annahme stationärer Bedingungen durchgeführt. Berechnen Sie die Gesamtplasmaglukoseerscheinungsrate aus dem M plus zwei Anreicherungen des Glukoseisotops und des Plasmas unter Verwendung etablierter Isotopenverdünnungsgleichungen.
Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. Die Rate der endogenen Glukoseproduktion entspricht der Gesamtplasmaglukoserate abzüglich der exogenen Glukose. Tabelle eins enthält die repräsentativen Ergebnisse der Studie.
Alle Einheiten werden als Milligramm pro Kilogramm und Minute ausgedrückt. Unter Verwendung zuvor beschriebener Isotopenverdünnungsgleichungen wurde die Gesamtplasmaglukoserate berechnet. In der Kontrollgruppe betrug die mittlere Glukoserate im Nüchternzustand 19,98.
Unter glukosereichen Bedingungen betrug die Glukoserate des Aussehens 25,8. Die Glukoseproduktionsrate betrug 19,08 im Nüchternzustand und 8,56 im glukosereichen Zustand. Abnormaler Glukosestoffwechsel und Homöostase sind bei PCOS häufig.
Bei Störungen des abnormalen Glukosestoffwechsels ist die Regulierung der Unterdrückung der Glukoseproduktion beeinträchtigt, was zu Hyperglykämie führt. In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Möglichkeit, die Rate der hepatischen Glukoseproduktion bei mehreren Mäusen gleichzeitig zu messen. Die kritischen Komponenten dieses Experiments sind die Kathetereinführung und die Definition der genauen Messungen des Glukoseisotops und der natürlichen Glukose, um GCMS angemessen durchzuführen.
Die Vorteile der Studie bestehen darin, die Infusion auf minimal-invasive Weise aufgrund der Einsetzen des Schwanzvenenkatheters durchzuführen, sowie die Verwendung eines leicht erreichbaren, stabilen Glukose-Tracers. Es gibt einige Einschränkungen für das Studium, einschließlich der technischen Anforderung des Verfahrens und der Notwendigkeit möglicher zusätzlicher Fähigkeiten. Insgesamt beschreiben wir eine einfache, genaue Methode, um die Rate der gesamten hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell zu messen.
Diese Technik könnte als Grundlage für mehrere Studien mit Glukosestoffwechsel von Mausmodellen dienen.
