Ziel dieses Verfahrens ist es, die Organisation und Dynamik der Mikrotubuli in vivo zu bewerten. Neuronen sind polarisierte Zellen mit ausgeprägten axonalen, dendritischen und synaptischen Kompartimenten, die durch ihr zugrunde liegendes Zytoskelett aufrechterhalten werden. Mikrotubuli bilden den Großteil des neuronalen Zytoskeletts, und die Dynamik und Orientierung bestimmen Schlüsselereignisse während der neuronalen Entwicklung und Reifung.
Mikrotubuli bestehen aus Alpha- und Beta-Tubulin-Heterodimeren und sind von Natur aus polarisiert mit hochdynamischen Plus-Enden und stabilen Minus-Enden. Während der Polymerisation an den Plus-Enden assoziiert sich ein multimolekularer Komplex von endbindenden Proteinen vorübergehend mit den Protofilamenten und fördert den Aufbau von Tubulindimeren. Diese Technik wird uns helfen, neuronale Mikrotubuli in vivo zu visualisieren.
Mit dieser Technik kann man die Orientierung und andere Parameter dynamischer Mikrotubuli während der Entwicklung und Regeneration des C.elegans-Neurons bestimmen. Wir verwenden diesen Reporter typischerweise, um die Dynamik von Mikrotubuli in sensorischen Neuronen zu visualisieren. Man kann diesen Reporter jedoch in anderen Zelltypen wie Muskeln und Haut ausdrücken, um dynamische Mikrotubuli in diesen Zellen zu visualisieren.
Fluoreszenzmarkierte endbindende Proteine wie EBP zu GFP erscheinen hier als Kometen. Die Dynamik dieser Kometen wurde mit dem gleichzeitigen Wachstum der Mikrotubuli korreliert und ist ein Schlüsselindikator zur Messung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli. Um diese Kometen in einem bestimmten Zelltyp zu beobachten, werden Transgene mit DNA aus EBP-2 und GFP unter einem spezifischen Promotor exprimiert.
Für die Expression in den PLM-Neuronen wird dieses Transgen unter der Marke für Promotor exprimiert. Diese transgenen Würmer können unter einem Stereomikroskop betrachtet werden, wobei die Fluoreszenz vor dem Sortieren oder Montieren eingerichtet wird. Für die Montage der Würmer zur Abbildung von EBP-Kometen stellen wir 10% Argos in M9-Puffer her.
und legen Sie einen Tropfen auf eine Glasrutsche. Ein weiteres Dia wird verwendet, um den Tropfen in einen Film zu drücken, der sich zu einem Pad verfestigt. Wir verwenden 0,1 Mikrometer, Polystyrolperlen als Montagemedium, ein paar Würmer werden gepflückt und in der Perlenlösung wieder aufgehängt.
Ein Deckzettel wird pochiert, um die Würmer zu immobilisieren und zur Bildgebung genommen. Die montierten können auf jedem Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera für hochauflösende Bildgebung abgebildet werden. Das Setup ist mit einer rotierenden Scheibeneinheit für eine schnellere Erfassung und reduzierte Fotobleiche und Fototoxizität ausgestattet.
Das Dia wird auf der Bühne gehalten und das Wurmfeld mit der Hellfeldbeleuchtung fokussiert und zentriert. Ein Objektiv mit geringer Vergrößerung wie 5X oder 10X kann für diesen Zweck verwendet werden. Die Würmer können bei gleicher Beleuchtung bei einem Objektiv mit hoher Vergrößerung wie 63X neu fokussiert werden.
Dieses Objektiv bietet eine optimale räumliche Auflösung für die Abbildung der Kometen. Eine feste Zentrierung des PLM-Neurons erfolgt unter der Fluoreszenzbeleuchtung, um eine übermäßige Lichteinwirkung und Fotobleiche des Prums zu verhindern. Für die Bilderfassung verwenden wir Sendesoftware außerhalb von Standorten.
Mit der Live-Imaging-Konfiguration im Hellfeldkanal fokussieren wir die Schwanzregion des Wurms und zentrieren sie im Sichtfeld. Es folgt die Fokussierung des PNM-Neurons mittels Lichtbildgebungskonfiguration mit 488 Nanometer Anregungslicht. Für eine Zeitraffererfassung wird eine experimentelle Einstellung erstellt, in der die Belichtungszeit, die Dauer des Zeitraffers und das Intervall zwischen den Frames die zeitlichen Fähigkeiten der Bildgebung definieren.
Für quantitative Messungen sollen einige Filme von EBP-Kometen auf Image J, einer Open-Source-Software, analysiert werden. Der erfasste Zeitraffer öffnet sich als Multi-Image-Strang, der als Film in der Vorschau angezeigt werden kann. In diesem speziellen Zeitraffer sind Kometen im Zellkörper, im vorderen und hinteren Prozess des PLM-Neurons zu sehen.
Die Kometen, die sich vom Zellkörper entfernen, werden als Plus-Ende-Out klassifiziert, und diejenigen, die sich in Richtung des Zellkörpers bewegen, werden als Minus-Ende-Out klassifiziert. Um die Analyse zu beginnen, wird eine segmentierte Linie über die interessierende Region gezogen, die in diesem Fall der innere Prozess des PLM-Neurons ist. Dieses Liniensegment wird mit hilfe der Reslice-Funktion von Bildern in einen Kymographen umgewandelt.
Ein Kymograph ist ein Distanzzeitbild mit diagonalen Falten, die die sich bewegenden Kometen darstellen. Auf diesen Leiterbahnen können geradlinige Segmente gezeichnet und Messparameter über das Analysemenü eingestellt werden. Diese Parameter können im Datenanalyseprogramm wie Excel in messbare Standardgrößen und -einheiten konvertiert werden.
Die Breite der Leiterbahn entspricht der Wachstumslänge. Die Höhe stellt die Wachstumsdauer dar, und der Winkel der Falte gibt die Richtung der Kometen an. Diese Kometen können weiter in Plus-Ende-Out und Minus-End-Out klassifiziert werden, um die relative Orientierung von Mikrotubuli zu finden.
Die transgene Expression von EBTA GFP kann angepasst werden, um die Dynamik von Mikrotubuli in verschiedenen zellulären Kontexten zu beobachten, z. B. bei der Neuregeneration. Um die Mikrotubulidynamik in den Region Rating Axons zu beobachten, wird das Axon mit einem Femtosekundenlaser verletzt, der das Axon präzise durchtrennen kann, ohne massive Kollateralschäden zu verursachen. Nach der Verletzung können die Würmer für spätere Beobachtungen auf ausgesäten Motorplatten geborgen werden.
PLM-Neuronen zeigen eine robuste Exoneree-Regeneration, die bereits sechs Stunden nach der Verletzung beobachtet werden kann. Um eine Phototoxizität zur Regeneration neuer Rechte zu verhindern, wird eine Live-Bildgebung in einem rotierenden Scheibenmikroskop durchgeführt. Zeitrafferaufnahmen der sich regenerierenden Axone können später in Kymographen für die Analyse von Kometen umgewandelt werden.
Die Entfernungsdauer und -richtung der Kometen kann dann in Bezug auf die Orientierung und Dynamik von Mikrotubuli interpretiert werden. Meine kritische Orientierung und Dynamik sind Schlüsselfaktoren ziviler zellulärer Prozesse wie Zellteilung, Migration und Aufrechterhaltung der Zellarchitektur. Obwohl es viele Werkzeuge für die Messung der Mikrotubulidynamik gibt, kann die In-vivo-Messung eine Herausforderung darstellen.
Autofluoreszenz, Phototoxizität, Überexpressionsartefakt und variabel berichtete Intensitäten sind einige der Schwierigkeiten, die bei der Live-Beobachtung von endbindenden Proteinen auftreten, um die Mikrotubulidynamik zu beurteilen. Durch die Verwendung eines integrierten transgenen Mittels mit geringer Konzentration deportierter DNA und geringer Beleuchtungsbildgebung hat sich diese Studie mit Methoden befasst, um einige dieser Herausforderungen zu mildern. Die hier beschriebenen Bildgebungs- und Analysemodule können auf andere Mikrotubuli-basierte Reporter und Proteintransporte ausgeweitet werden.
Dies gilt nicht nur für C.elegance-Neuronen, sondern auch für andere Zelltypen und Modellsysteme.
