Wir danken Anne-Marie Dion-Côte für Diskussionen, die zur Entwicklung der Methode. JK und RB FQNRT Doktor Gelehrten, ist ein M.-MG Vanier CIHR Gelehrter und J.-YM ist ein FRSQ Senior Researcher. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Natural Sciences and Engineering Research Council zu JY unterstützt. M.

1. Herstellung von rekombinantem Baculovirus Baculoviren werden unter Verwendung des Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem von Invitrogen hauptsächlich in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers mit nur geringen Modifikationen erzeugt: <ol><li> Eine modifizierte pFastBac1 Vektor (Gibco, Leben) wurde mit der GST-und His-Tags (Abbildung 2) erstellt. Die Multiklonierungsstelle (MCS) von einem pET-52b (+)-Vektor (Novagen) und enthält einen 10xHis-Tag, wurde in die MCS eines pFastBac1 Vektor eingesetzt, um pFastBac1-Strep-10xHis generieren. Die pET-52b (+) MCS-Sequenz wurde PCR zwischen den XbaI und BlpI Restriktionsstellen verstärkt, indem eine BglII-Restriktionsstelle am 5&#39;-Ende und eine HindIII-Schnittstelle am 3 &#39;Ende. Das PCR-Produkt wurde dann zwischen BamHI und HindIII-Restriktionsstelle von pFastBac1 kloniert, mit der Kompatibilität der BamHI-und BglII-Restriktionssequenzen. Da das Ziel war, eine pFastBac1, die die Expression erzeugenrekombinante Protein mit Streptavidin-und 10xHis-Tags, die BamHI-Restriktionsstelle des pET-52b (+) MCS-Sequenz wurde nicht verwendet. Auch wurde die XbaI-Restriktionsstelle nicht verwendet werden, um die Redundanz von Restriktionsstellen zwischen den Standorten bereits in der MCS von pFastBac1 und diese mit der MCS von pET-52b eingesetzt (+) auftretenden vermeiden. Die GST kodierende Sequenz mit der PreScission Protease-Erkennungsstelle (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) wurde dann in pFastBac1-Strep-10xHis eingefügt. Die GST-cDNA-Sequenz von pGEX-6P-2 (GE Healthcare) wurde PCR amplifiziert mit Primern, welche NcoI und KpnI-Restriktionsstellen an den 5&#39;-und 3&#39;-Enden auf. Die NcoI-Stelle ermöglicht das Hinzufügen eines Start-Codon, sondern auch ein Alanin an der GST. Das PCR-Produkt wurde anschließend zwischen die NcoI und KpnI-Restriktionsstellen in pFastBac1-Strep-10xHis kloniert, was zu dem Löschen des Streptavidin-tag. Die so erhaltene neue Fusion Vektor wurde mit pFastBac1-GST-10xHis. </li><li> Klonen der cDNA-Kodierung für die protein von Interesse in das pFastBac-GST-10xHis Vektor zwischen dem GST (N-terminal) und dem His-Tag (C-terminal). Seien Sie vorsichtig, um die cDNA-Stop-Codon entfernen, um die Fusion mit der C-terminalen His-Tag zu ermöglichen. </li><li> Trans E. coli DH10Bac mit dem rekombinanten pFastBac (im Schritt 1.2) erhaltenen, die Bacmid erzeugen. Ermöglichen Kolonien über Nacht bei 37 ° C und mehrere Stunden bei 30 º C auf Platten, die Auswahl Bluo-gal und IPTG (10 ug / ml Tetracyclin, 50 &amp;mgr; g / ml Kanamycin, 7 &amp;mgr; g / ml Gentamycin, 100 &amp;mgr; g / ml Bluo-wachsen Gal, 40 ug / ml IPTG). </li><li> Pick und restreak 2 weiße Kolonien (aus Schritt 1.3) auf Selektionsplatten, um den weißen Phänotyp zu bestätigen. </li><li> Beimpfen von 2 ml LB, enthaltend 10 ug / ml Tetracyclin, 50 &amp;mgr; g / ml Kanamycin, 10 ug / ml Gentamycin mit den beiden weißen Kolonien aus Schritt 1.4 und ließ sie über Nacht unter Schütteln bei 37 ° C wachsen (250 rpm) </li><li> Um die Bacmid-DNA/CellFECTIN-Gemisch reinigen, zu pelletieren, die Bakterien von Schritt 1.5,Resuspendieren der Zellen in 300 ul Lösung I und 300 ul Lösung II (Maxiprep Kit von Qiagen). Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur, fügen Sie 300 ul 3 M KOAc pH 5,5 und Inkubation für 10 min auf Eis. Zentrifugieren der Proben bei 4 ° C, maximale Geschwindigkeit für 10 min. In 800 ul von Isopropanol zu den Überständen und Inkubation für 10 min auf Eis. Zentrifugieren der Proben für 15 min bei 4 ° C und Waschen des Pellets mit 500 ul 70% Ethanol. Lassen Sie das Pellet zu resuspendieren es trocken und unter sterilen Bedingungen in 40 &amp;mgr; l Tris-EDTA pH 8,0. Die Bacmid-DNA bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Generieren Baculoviren wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Baculoviren bei 4 ° C lichtgeschützt gelagert werden. </li></ol> 2. Rekombinante Proteinexpression <ol><li> Um die effizienteste Baculovirus zur Reinigung zu wählen und zu überwachen, wann der Spitzenwert der Proteinexpression zu erreichen, so wird ein Mini-Infektionstest eins folgt: Infect 2 × 10 7 Sf9-infizierten Zellen kultiviert bei 27 ° C in Grace-Medium (mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt) mit 133 ul (1/150) des Baculovirus. Sammeln Aliquots von 1,5 ml bei 0, 24, 48 und 72 h nach der Infektion. Pelletierung der Zellen und Analyse der Expressionsspiegel des Proteins von Interesse durch Western-Blotting unter Verwendung von anti-Tag-Antikörper. </li><li> Verwenden die effizienteste Baculovirus von Schritt 2.1, eine Zentrifuge, die 1,0 × 10 6 Sf9-Zellen pro ml in 500 ml Medium in einem Verhältnis von 1/150 zwischen Virus und Medium zu infizieren. Lassen die infizierten Zellen wachsen in Suspension bei 27 ° C und Ernte der Zellen, wenn die maximale Protein-Expression (wie im Schritt 2.1 bestimmt wird) erreicht ist. Pelletierten Zellen können bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li></ol> 3. Herstellung von löslichem Zelllysat Alle folgenden Inkubationsschritte werden bei 4 ° C unter leichten Drehgeführt. <ol><li> Lyse SF9 Zellen, die Protein von Interesse exprimieren, in ~ 20 ml GST-Bindungspuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT in PBS1X für eine Endkonzentration von 250 mM NaCl und Proteaseinhibitor Cocktail (Roche). In einem Eis-Wasser-Bad, Dounce der Lösung 20x mit einem Dounce Homogenisator beschallen jeweils 3x 30 Sekunden (70% Leistung) und DOUNCE wieder 20x. </li><li> (Optional). Inkubieren der Gesamt Zelllysats mit 1 mM MgCl 2 und 7 Nuklease Benzonase (2,5 U / ml) für 30 min bei 4 ° C auf DNA-oder RNA-Kontamination zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 18.000 rpm für 30 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand. </li><li> (Optional). Zentrifuge der Überstand erneut für 30 min bei 18.000 rpm bei 4 ° C, um eine klare lösliche Lysat zu erhalten. Führen Sie den Überstand durch ein 0,2 oder 0,45 um Filter, um ein Verstopfen zu vermeiden. </li></ol> 4. Die Bindung von Protein an GST Perlen <ol><li> Inkubieren des löslichen Zell-Lysat mit 1 ml GST-Kügelchen (vorgewaschen zweimal mit10 ml GST-Bindungspuffer) für 1 h bei 4 º C unter leichter Rotation. </li></ol> Kommentar: Die Inkubationszeit muß nach der Stabilität des Proteins und Bindungseffizienz optimiert werden. <ol start="2"><li> Schnell Spin bei 700 rpm und Überstand entfernen ungebundenen Proteine ​​enthält (dies kann zur weiteren Analyse aufbewahrt werden). Waschen der gebundenen Proteine ​​GST-(3B, Spur 1) mit Waschpuffer GST (GST-Bindungspuffer mit 350 mM NaCl endgültig). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.2 2x. Bei der letzten Waschung zu entfernen, so viel Überstand wie möglich. </li><li> Der Kügelchen mit 5 mM ATP und 15 mM MgCl 2 inkubieren (in 10 ml Bindungspuffer GST) für 1 h bei 4 ° C nicht-spezifische Bindung des Hitzeschock-Proteine ​​8 zu vermeiden. Dreimal mit Waschpuffer GST Waschen der Kügelchen. </li></ol> 5. PreScission Spaltung des GST <ol><li> Zentrifugieren Sie die GST-Perlen, den Überstand entfernen und waschen Sie die GST Perlen mit P5 buffer (50 mM NaHPO 4, pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% Glycerin, 0,05% Triton-X-100, 5 mM Imidazol). </li><li> Die GST-Kügelchen mit PreScission Enzym in Puffer inkubieren P5 von 3 h bis über Nacht bei 4 ° C. (Teile die GST-Kügelchen in Fraktionen von 100 &amp;mgr; l hinzugefügt und 4-8 Einheiten (2-4 &amp;mgr; l) des Enzyms in 100 ul Puffer verdünnt, P5). </li></ol> Kommentar: Die Inkubationszeit der PreScission Schritt muss nach dem Molekulargewicht als auch die Stabilität des Proteins zu optimieren. Ein Abbau beobachtet, kann dieser Inkubationszeit auf ein Minimum von 2 Stunden statt über Nacht verringert werden. <ol start="3"><li> Schnell Spin und sammeln den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei Zeitpunkten nach Zugabe von 100 ul P5 Puffer zu den Perlen und bündeln alle Fraktionen (3B, Spur 2). </li></ol> Kommentar: Die restlichen Perlen können für die Analyse der Spaltungseffizienz verwendet werden (Abbildung 3B </strong&gt;, Spur 3). Üblicherweise wird 70-80% des Proteins abgespalten. 6. Protein-Bindung an TALON Metall Affinity Resin <ol><li> Teilen Sie die Elution von oben in 3 Fraktionen von 1 ml und Inkubation mit jeweils 100 ul Talon Metallaffinitätsharz Trockenperlen (zweimal mit Puffer P5 vorgewaschen) für 1 h unter Rotation. </li></ol> Kommentar: Die Aufteilung der Elution in mehrere Fraktionen erhöht die Bindung / Wascheffizienz. <ol start="2"><li> Mit P30-Puffer (P5 Puffer mit einer Endkonzentration von 30 mM Imidazol) Das Harz 5 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6,2 und 2x bündeln die Perlen in einer einzigen Röhre. Vor dem letzten Waschvorgang, zu entfernen, so viel Überstand wie möglich. </li></ol> Kommentar: Dies entspricht der TALON gebunden Probe (3B, Spur 4). 7. Elution des gereinigten Proteins <ol><li> Inkubation des Protein gebunden TALON Harz für 5 min unter Rotation mit P500 Puffer (P5 Puffer mit einer Endkonzentration von 500 mM Imidazol). Verwenden Sie ein Verhältnis zwischen Puffer und Perlen von 1:1 v / v (Zum Beispiel, wenn Sie 200 ul Trockenperlen genommen hatte, haben Sie zu 200 ul P500 hinzufügen). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und halten jede eluierte Fraktion separat (benannt Elution 1 (E1), Elution 2 (E2) und Elution 3 (E3), 3B, Bahnen 5-7). </li></ol> Kommentar: Die restlichen Perlen können für die Analyse der Effizienz der Elution (3B, Spur 8) verwendet werden. Typischerweise wird 60-80% des Gesamtproteins in eluiert. <ol start="2"><li> Analysieren Sie die Menge und die Qualität der gereinigten Protein durch Laden ca. 20-40 ul jeder Fraktion mit einem Standard-BSA-Konzentration auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung mit (3B) oder SYPRO Protein-Färbung für die Visualisierung. </li></ol> Bemerkung: Das Protein von Interesse kann auch erkannt werden throughout des Reinigungsverfahrens unter Verwendung von Anti-GST-und Anti-His-Antikörper (Fig. 3C). 8. Lagerung des gereinigten Proteins <ol><li> Dialyse des gereinigten Proteins gegenüber einer entsprechenden Speicherpuffer (z. B. 20 mM Tris-Acetat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) bei 4 ° C. Es ist wichtig, zur Ausfällung des gereinigten Proteins während der Dialyse zu überprüfen. Wir dialysieren Regel 2x für 1 h bei 4 ° C unter Rühren Rotation. </li><li> Machen Sie kleine Aliquots des gereinigten Proteins (10-20 ul) und frieren auf Trockeneis für 30 min. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 ° C und vermeiden viele Tau-/ Gefrierzyklen. </li></ol>

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Die hier vorgestellte GST-His Reinigungsprotokoll ist geeignet für die Reinigung von einer breiten Palette von Größen von rekombinanten Proteinen: Wir haben erfolgreich gereinigt Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) und eine instabile hochmolekularen Protein von Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Außerdem wurden die Proteine ​​mit diesem Protokoll gereinigt biochemisch aktiven 6. Der Erfolg dieser Methode hängt nur von der Expression, Löslichkeit und Stabilität des gewünschten Proteins. Molekularbiologie Vektoren zur Expression in anderen Wirten, wie E. coli oder Hefe, kann leicht geändert werden mit dem weithin verfügbar GST und His-Tags. Dies unterstreicht die Anwendbarkeit und Wirtschaftlichkeit der vorliegenden Technik für die meisten molekularbiologischen Labors. Eine Vielzahl von Vorteilen beeinflusst unsere Entscheidung, infizierte Zellen über Bakterien-oder Säugerzellen für recombinan wählent-Proteinexpression und-reinigung. Zum Beispiel können posttranslationale Modifikationen, wie Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung starken Einfluss auf die enzymatische Funktion eines Proteins 10. Daher, um die physiologischen Eigenschaften des Proteins zu untersuchen, ist es günstig, ein System, das für eine posttranslationale Modifikation ermöglicht, wie Sf9-infizierte Zellen zu verwenden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Sf9 über Säugerzellen, zum Beispiel, das wirtschaftlicher Natur, da die infizierten Zellsystem deutlich weniger Zellen und keine kostspieligen Verfahren der Transfektion gegenüber Säugetiersystem erfordert. Die Einfachheit des Verfahrens vorgestellt werden Forscher dazu beitragen, ein Protein oder Proteinkomplexes in einer hoch gereinigten Form mit Standard-Laborausrüstung, die für ein Labor mit minimaler Ausrüstung vorteilhaft erhalten.

Die Reinigung von rekombinanten Proteinen ist entscheidend, um grundlegende Fragen in der Biochemie adressieren. Herkömmliche Wege zur Proteinreinigung, wie Ionenaustausch-Chromatographie und Größenausschluss-Chromatographie verlassen sich auf die physikalischen Eigenschaften des Zielproteins wie seinem isoelektrischen Punkt und Ladung oder Grße sind. Letztere Proteineigenschaften werden durch eine Vielzahl von Proteinen, die wesentlich die Wahrscheinlichkeit von verunreinigenden Proteinen in herkömmlichen Proteinreinigungsstrategien erhöht geteilt. Dieses Problem kann mit der Verwendung von mehreren Reinigungssäulen, die zeitaufwendig ist, umgangen werden. Zur gleichen Zeit werden die letzteren Chromatographie-Verfahren erfordern teure Versuchsaufbau. Affinitäts-Tag-Reinigung stark erhöht Zielspezifität, wie in den meisten Fällen der Tag einzigartig für das Protein von Interesse sein. In neueren Studien wurde Flag-oder HA-Affinitätsreinigung weit verbreitet. Im Gegensatz zu bestehenden recombinant Proteinreinigungsprotokolle, in denen einzelne Tags verwendet werden, haben wir die einzigartige Kombination von zwei Tags. Unser Verfahren umfaßt die Fusion eines GST-Tag am N-Terminus und ein His-tag am C-Terminus des Proteins von Interesse, für ein optimales Verhältnis zwischen der Menge und Reinheit des gewünschten Proteins. Die GST ist ein langer Tag (29 kDa), die hocheffiziente zur Reinigung an Glutathion-Sepharose-Kügelchen ist. Darüber hinaus unter Verwendung von GST garantiert Wirtschaftlichkeit unserer Methode 1. Die Möglichkeit, mit dem PreScission Enzym (mit Erkennungssequenz LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, was die Zugabe von nur zwei Aminosäuren) Abspaltung der GST hat viele Vorteile, zum Beispiel, vermeidet diese Strategie Veränderungen der physiologischen Proteinfunktionen durch allosterische Hindernis. Die kleine His-Tag auf den anderen Protein fusioniert Extremität dient in einem zweiten Reinigungsschritt zur Proteinreinheit durch Abwaschen des gespaltenen GST, als auch abgebaut Proteine ​​und andere erhöhen<html> Verunreinigungen. Zusätzlich kann das Protokoll nicht eine Dialyseschritt, wenn von dem GST an den His-Reinigungsschritt Säule (TALON Harz) erforderlich. Gemeinsame Verunreinigungen in solchen Reinigungsverfahren sind Hitzeschockproteine ​​(HSP). Die Zugabe von einem Inkubationsschritt mit MgCl 2 und ATP ermöglicht die Entfernung dieser Verunreinigungen (Abbildung 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) sind übliche Techniken, die auf teure Geräte abhängen hohe Ausbeute des gereinigten Proteins von Interesse zu erzeugen. Die Batch-Reinigungsprotokoll wir hier präsentieren, im Gegensatz dazu ist manuell und nicht eine teure Instrumental Setup erfordern. Eine hohe Ausbeute an Protein durch Aufstockung des Protokolls erreicht werden. Zur gleichen Zeit, mit der Chargenreinigungsprotokoll, das Elutionsvolumen kann, um die Proteinkonzentration, die nicht mit FPLC oder HPLC gegeben erweitern eingestellt werden. ntent &quot;&gt; Auch mit der Batch-GST-His Reinigungsprotokoll, Proteine ​​mit einem Größenbereich von ~ 10-300 kDa gereinigt werden. Einer der größten Vorteile ist durch die Tatsache gegeben, dass man mehrere Proteine ​​gleichzeitig zu reinigen beispielsweise sowohl ein Wildtyp und ihrer Mutanten-Protein. Der Erfolg der dargebotenen Protokoll hängt ausschließlich vom Expressionsniveau und die Löslichkeit des Proteins von Interesse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Schlüssel Assays in Enzymology für die biochemische Charakterisierung von Proteinen in vitro erfordern hohe Konzentrationen des gereinigten Proteins von Interesse. Proteinreinigung Protokolle sollten Effizienz, Einfachheit und Kosteneffektivität 1 kombinieren. Hier beschreiben wir die GST-His Verfahren nach einem neuen kleinen Affinitätsreinigungssystem für rekombinante Proteine, basierend auf einem N-terminalen Glutathion-Sepharose-Tag (GST) 2,3 und ein C-terminales 10xHis-Tag 4, der sowohl verschmolzen an das Protein von Interesse. Das letztere Konstrukt wird verwendet, um Baculoviren zu erzeugen, zur Infektion von Sf9-infizierten Zellen für die Proteinexpression 5. GST ist ein ziemlich langer Tag (29 kDa), die Reinigungsleistung zu gewährleisten dient. Allerdings könnte es physiologischen Eigenschaften des Proteins beeinflussen. Daher wird in der Folge aus dem Protein unter Verwendung des Enzyms PreScission 6 gespalten. Um maximale Reinheit zu gewährleisten und die gespaltenen GST entfernen, wirfügte eine zweite Affinitätsreinigungsschritt auf der Basis der vergleichsweise kleinen His-Tag. Wichtig ist, dass unser Verfahren auf zwei verschiedene Tags flankieren die beiden Enden des Proteins, das ein leistungsfähiges Werkzeug, um abgebaute Proteine ​​zu entfernen, und daher ist basiert, reichert Proteine ​​in voller Länge. Das hier vorgestellte Verfahren erfordert nicht eine teure instrumental Einrichtung, wie FPLC. Darüber hinaus haben wir MgCl 2 und ATP wäscht integriert, um Hitzeschockprotein Verunreinigungen und Nukleasebehandlung abzuschaffen kontaminierenden Nukleinsäuren zu entfernen. Zusammenfassend ist die Kombination von zwei verschiedenen Variablen flankieren die N-und C-terminalen und die Fähigkeit zur Abspaltung eines der Tags, garantiert die Rückgewinnung eines hochgereinigten und Volllängen-Protein von Interesse.

Um die Effizienz des GST-His-Reinigungsprotokolls veranschaulichen, reinigten wir Rec14, einen S. pombe Protein von 32,9 kDa. Die Rec14 cDNA wurde in unserer modifizierten pFastBac1 Vektor ermöglicht die Zugaben von GST-und His-Tags an der N-und C-Termini, die jeweils (1A) kloniert. Rekombinanten Baculovirus wurden hergestellt und verwendet, um Sf9-infizierten Zellen für die Proteinexpression zu infizieren. Die löslichen Zelllysate wurden mit GST inkubiert und Perlen-gebundenen Proteine ​​wurden durch Spaltung der GST mit PreScission Protease eluiert. Die daraus resultierende Rec14-His Protein war Affinität auf TALON Harz und gebundene Proteine-gereinigt wurden mit TALON-Puffer mit 500 mM Imidazol eluiert. Gereinigtes Rec14-His wurde in Lagerpuffer dialysiert und bei -80 ° C (Fig. 1B) gespeichert ist. Die löslichen und Gesamtzell-Lysaten von SF9-Zellen mit dem rekombinanten Baculovirus Rec14 oder als Steuer Mock-infiziert, wurden von Coom analysiertAssie-Blau-Färbung, so dass wir die Expression von GST-Rec14-His-Protein (3A) bestätigen. Während des Reinigungsverfahrens wurden viele Proben analysiert, um die Effizienz des Verfahrens zu folgen. Die Analyse dieser Proben durch Coomassie-Blau-Färbung (Fig. 3B) zeigt, dass im ersten Schritt der Reinigung, GST-Rec14 korrekt an GST Perlen aufgrund der Fusion von Rec14 (32,9 kDa) gebunden ist, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ~ 60 kDa mit GST (29 kDa) (Spur 1). Nach PreScission Spaltung der GST, GST-kostenlos Rec14-His wandert etwa 37 kDa (Spur 2), während die gespaltenen GST auf der GST-Perlen (Bahn 3, ca. 25 kDa) visualisiert werden. Trotz eines Teils der GST-kostenlos Rec14, die noch blieb, um GST-Kügelchen (Bahn 3), bemerkenswerte Bereicherung in gebundener Rec14-His wurde (Spur 2, ohne Verunreinigung auf Coomassie-Blau-Färbung sichtbar) erreicht. Dieser Schritt kann durch eine Erhöhung der Inkubationszeit des Proteins mit PreScission verbessert werden. Analyse der Rec14-Sein gebunden an TALONPerlen (nach Schritt 7.1, Spur 4), verglichen mit den Proteinen GST nach Reinigung (Spur 2) eluiert wird, zeigt, dass ein großer Anteil der Rec14-His ist TALON Kügelchen gebunden. Nach mehreren Wäschen Rec14-His wurde eluiert und gesammelt. Drei Elutionen durchgeführt worden war. Die Analyse zeigte eine hohe Reinheit des Rec14-His (keine Verunreinigung durch Coomassie-Färbung sichtbar, Spuren 5 bis 7), und die größte Konzentration von Rec14-His in der ersten Elution. Vergleich der eluierten Fraktionen (Spuren 5 bis 7) zu den TALON Perlen nach der Elution (Spur 8) veranschaulicht die Effizienz der Elution, da nur wenige Rec14-His detektiert werden, die auf Kügelchen gebunden. Proben in 3B verwendet wurden, um Western-Blot-Analyse mit anti-GST und anti-His-Antikörper, um Rec14 während des gesamten Verfahrens (3C) folgen unterzogen. Die anti-GST-Blot zeigt, dass einige GST-Rec14 und GST alleine, in den eluierten Proteine ​​aus dem GST-Reinigungsstufe (Spur 2) vorhanden waren, und than Verunreinigungen wurden durch das His-Tag-Affinitätsreinigungsschritt entfernt. Dieser Blot ermöglicht uns auch, zu überwachen, dass GST war effizient aus Rec14 vom PreScission Behandlung und die His-Tag-Reinigungsschritt (Spuren 4 bis 8) entfernt wird. Die Anti-His-Blot soll Rec14 erfassen. So können wir bestätigen, dass GST-Rec14-His-His und Rec14 nicht vollständig gespalten und von den GST-Perlen (Bahn 11) entfernt. Außerdem bei einer hohen Konzentration scheint Rec14 zu aggregieren (Spur 13). Zusammenfassend sind die Ergebnisse dargestellt sind, zeigen die Wirksamkeit des GST-His-Reinigung für die Reinigung von S. pombe Rec14. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung des GST-His-Zwei-Schritt-Affinitätsreinigungsverfahren. A. Rec14 GST-His-Konstrukts in pFastBac (Baculovir kloniert. uns Expressionsvektor) B. Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung von GST-Rec14-His aus Sf9 lösliche Zelllysat:. GST-Bindung, gefolgt von PreScission Spaltung der GST, TALON-Bindung und Elution mit Imidazol <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50320/50320fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig2.jpg" /> 2. Schematische Darstellung der pFastBac1-GST-10xHis. GST (grün), PreScission Proteasestelle (hellblau), die Multiklonierungsstelle (rot), und die 10-His-Tag (dunkelblau) dargestellt. In Kleinbuchstaben sind die Nukleotid-Sequenzen aus pET-52b Ursprung (+). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50320/50320fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50320/50320fig3.jpg" /> 3. Beispielhafte Ergebnis der GST-His Reinigung von Rec14. A. Coomassie-Färbung der Gesamtproteinfraktion (Spur 2 und 3) und lösliche Zelllysat (Spur 4 und 5) von scheinbehandelten Sf9-Zellen (Spur 2 und 4) oder mit GST-His-Rec14 Baculovirus (Bahn 3 und 5) infiziert. Rec14 GST-His und besitzen ein Molekulargewicht von etwa 32,9 kDa und 29 kDa, und das GST-Rec14-His-Fusionsprotein ein Molekulargewicht von etwa 61,9 kDa. B. Coomassie-Färbung zeigen jeden Schritt von Proteinreinigungsverfahren (beispiels Detaillierte Erklärung siehe Verfahren) C. Western-Blot der Fraktionen nach dem Reinigungsverfahren mit anti-GST (Spur 1 bis 8) und anti-His (Spur 9 und 16) Antikörper.upload/50320/50320fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

In dem vorliegenden Protokoll, zeigen wir eine hocheffiziente und kostengünstige kleine Proteinreinigungsverfahren, die die Reinigung von rekombinanten Proteinen ermöglicht dank einer einzigartigen Kombination eine spaltbare GST-Tag und einen kleinen His-Tag.

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

41.7K Aufrufe.  Hôtel-Dieu de Québec.  In dem vorliegenden Protokoll, zeigen wir eine hocheffiziente und kostengünstige kleine Proteinreinigungsverfahren, die die Reinigung von rekombinanten Proteinen ermöglicht dank einer einzigartigen Kombination eine spaltbare GST-Tag und einen kleinen His-Tag. 

Serie: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Forschung

Biochemie

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Strategien zur Expression und Reinigung von Transportern gelöster Stoffe

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autor im Rampenlicht: Expression und Aufreinigung von humanen Trägertransportern für gelöste Stoffe unter Verwendung von Codon-optimierten Genen 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunologie und Infektion

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biologie

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Zusammenfassung

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Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated