Heute werden wir eine Methode demonstrieren, um eine Peptidbibliothek gegen einen kürzlich entdeckten Master-Rezeptor zu screenen, den Mas-verwandten G-Proteinrezeptor X2, auch bekannt als MRGPRX2-Rezeptor. Mastzellen sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems und spielen eine entscheidende Rolle sowohl bei angeborenen als auch bei adaptiven Immunantworten. Mastzellen werden entweder durch den antigengebundenen Fc-Epsilon-R1-Rezeptor oder durch den kürzlich entdeckten X2-Rezeptor aktiviert.
Die Aktivierung des oberflächengebundenen X2-Rezeptors wurde mit mehreren immunologischen und entzündeten Krankheiten in Verbindung gebracht, und daher ist es wichtig, den Bindungsmechanismus dieses Rezeptors an seine Liganden zu verstehen. Dazu haben wir eine Bibliothek kleiner Peptidmoleküle entwickelt und sie gegen X2-Rezeptoren gescreent, die auf Hexis überexprimiert sind. In der Studie wurde eine Peptidbibliothek mit einfachen und vielseitigen Techniken des Alanin-Scannens und Aminosäurekürzungen erstellt.
Heck293 sagt, dass exprimierende X2-Rezeptoren, wenn sie mit den Peptiden und Wide-Type-Hexis aktiviert wurden, als Kontrolle verwendet wurden. Die Freisetzung bei der Kürzung bei aktivierung wurde überwacht, um die X2-basierte Aktivierung zu untersuchen. Experimentell wird Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye bei 340 und 380 Nanometern angeregt, während die Emission bei 510 Nanometern aufgezeichnet wird.
Bei der Calciumbindung nimmt die Fluoreszenzintensität bei 340 zu, während die von 380 Nanometern abnimmt. Der Farbstoff wird dann im Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei 340 zu dem von 380 Nanometern abgeschieden. Die 340 eines 380-Verhältnisses, ist proportional zum intrazellulären Kalzium, der Wert davon kann durch die Grynkiewicz-Gleichung berechnet werden.
Das Tabbing-Verhältnis von zwei Fluoreszenzdicken, die Wirkung experimenteller Faktoren wie Verdünnung, Photobleaching, Farbstoffleckage und Duftdichten werden detektiert. Also, ohne weitere Verzögerung, lassen Sie uns das Experiment beginnen. Um die Liganden des MRGPR X2-Rezeptors der Mastzelle zu identifizieren, generatorieren Sie die N-truncated, C-Truncated und N+C-Truncated Peptide Library, indem die N-terminalen, C-terminalen und N+C-terminalen Aminosäuren der Pam-12-Fehlproktivität abgeschnitten werden.
Verwenden Sie die Festphasenpeptidsynthese, um die Peptide zu synthetisieren. Ändern Sie den Endterminal in eine festgelegte Gezeitengruppe und den C-Terminal in eine Amidgruppe. Generieren und Alanine können Peptidbibliotheken erzeugen, indem sie die jeweiligen Aminosäuren von Pam-12 durch Alanin ersetzen, eine nach der anderen.
Ändern Sie die Endklemme in eine Setidgruppe und die C-Terminal in eine Amidgruppe. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie DMEM mit hohem Glukosegehalt mit 10% fetalem Rinderserum, zwei Millimolar-L-Glutamin, hundert Einheiten pro ml Penicillin und hundert Mikrogramm pro ml Streptomycin ergänzen. Neben den Zellen in Tee Sue-Kultur sind 375 Kulturkolben bei 37 Grad Celsius, 5% CO2, bis sie zu 75 bis 80% konfluent sind.
Sobald 75% konfluent, waschen Sie die Zellen und fügen Sie zwei bis drei ml Proof-C hinzu, um die Zellen zu lösen. Sobald sich die Zellen gelöst haben, sammeln Sie die Zellen in Proof-C. Fügen Sie sechs bis neun ml frisches Medium hinzu.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1620g für drei bis fünf Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen, um das Pellet zu sammeln. Resuspendieren Sie die Zellen in frischem Kulturmedium.
Verdünnen Sie die Zellen gemäß der gewünschten Konzentration. Bei 200 Mikrolitern der Zellsuspension mit der Konzentration von 200.000 Zellen gießen Sie den Ambon in jede Vertiefung, um 40.000 Zellen pro Vertiefung zu suchen. Bewachen Sie die Zellen 24 Stunden lang im 37 Grad Celsius, 5% CO2-Inkubator.
Verwenden Sie Fura-2 AM Farbstoff für das Experiment. Fügen Sie 50 Mikroliter DMSO in 50 Mikrogramm Fura-2 AM hinzu, um eine millimolare starke Lösung von Fura-2 AM-Farbstoff herzustellen. Fügen Sie einen Mikroliter eines millimolaren Fura-2 AM-Farbstoffs pro ml frischem Medium hinzu, um das Verdünnungsmedium einer mikromolaren Farbstoffkonzentration herzustellen.
Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Verdünnungsmedium. Fügen Sie 200 Mikroliter verdünnendes Medium in jede Vertiefung hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen für 30-40 Minuten in 37 Grad Celsius, 5% CO2-Inkubator. Während die Zellen inkubiert werden, stellen Sie den Plattenleser ein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.
Wählen Sie in den Einstellungen Flex aus. Stellen Sie den Lesemodus auf Fluoreszenz und Bottom Read ein. Legen Sie unter Wellenlängen die Anzahl der Wellenlängen auf zwei fest.
Stellen Sie die Anregung auf 340 Nanometer und 380 Nanometer ein. Stellen Sie die Emission auf 510 Nanometer ein. Lassen Sie die Empfindlichkeit auf Standard.
Legen Sie unter Timing das Intervall auf 3,9 Sekunden fest. Legen Sie die Laufzeit auf 94 Sekunden fest, um 25 Lesezahlen zu erhalten. Wählen Sie als Nächstes den Assay-Plattentyp aus.
Wählen Sie als Nächstes die zu lesenden Wells aus. Legen Sie in Compound Transfer transfers auf eins und Initial Volume auf hundert Mikroliter fest. Stellen Sie die Pipettenhöhe auf hundert Mikroliter, die Lautstärke auf 50 Mikroliter und den Zeitpunkt auf 36 Sekunden ein, um die Verbindung hinzuzufügen und den Messwert zu pflegen.
Wählen Sie als Nächstes den Plattentyp Compound Source aus. Lassen Sie Triturate nicht verwenden. Wählen Sie das Layout Spitzen und Pipettenspitzen aus.
Bei Compound- und Tip-Säulen wird die Verbindung in Spalte eins der Compound-Platte übertragen. Legen Sie die Tippspalte auf eins und die zusammengesetzte Spalte auf eins fest. Lassen Sie AutoCalibrate auf Ein.Klicken Sie auf OK. Nach 40 Minuten Inkubation das Medium entfernen.
Waschen Sie die Zellen mit dem XDB-Puffer. Fügen Sie hundert Mikroliter XDB-Puffer zum Fluoreszenzlesen hinzu. Nehmen Sie die Platte zum Fluoreszenzlesen.
Wenn pritchett 37 Grad Celsius erreicht hat, drücken Sie die Lesekammer, um die Assay-Platte in den Fluoreszenzplattenleser zu legen. Drücken Sie die Quelle, um die zusammengesetzte Platte einzulegen. Bereiten Sie die zusammengesetzte Platte vor, indem Sie 200 Mikroliter der angesehenen Peptide Ionomysin und EGTA hinzufügen, um X-Lösungen zu erhalten.
Drücken Sie die Spitze pratt, um die Spitzenbox zu setzen. Verwenden Sie die schwarze Spitze, um eine Autofluoreszenz der Spitze zu vermeiden. Sobald die Platten aufbewahrt wurden, und wenn Sie die Einstellungen der Software verwenden und lesen.
Bestimmen Sie die Kalziumkonzentration aus dem Fluoreszenzverhältnis durch die Grynkiewicz-Gleichung. Gezeigt werden die Fluoreszenzdaten von pam gutem Peptid. Wie zu sehen ist, nimmt nach Peptidzugabe nach 36 Sekunden die Fluoreszenz bei 340 Nanometern, die lauer ist, um die von 380 Nanometern Rekord ab.
Die Daten werden als Verhältnis von 340 zu dem von 380 Signal dargestellt. Sie zeigen, dass die Signale nach Peptidzugabe zunehmen. Diese Zahl ist die repräsentative Daten für ein aktivierendes Peptid.
Abbildung A zeigt die Fluoreszenzsignale für ein aktivierendes Peptid. Repräsentative Daten entsprechen cram12 Peptide wurde hinzugefügt, nachdem eine Baseline für Ausschreibungszyklen erstellt wurde, wie der ado zeigt. Abbildung B zeigt das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 Nanometer zu dem der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 380 Nanometern.
Diese Zahl ist die repräsentativen Daten für das Leerzeichen. Abbildung A zeigt die Fluoreszenzsignale für den Rohling. HTB wurde nach Verdünnung einer Baseline für 10 Fütterungszyklen hinzugefügt, wie im ado gezeigt.
Abbildung B zeigt das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 Nanometern zu dem der Floreszenzemission nach Anregung bei 380 Nanometern. Diese Zahl sind die repräsentativen Daten für die Standards für die Farbstoffkalibrierung. Abbildung A zeigt, dass Ionomycin bei den 10. Messwerten hinzugefügt wurde, wie der ado zeigt, um eine maximale Fluoreszenz im Cashem-gebundenen Zustand zu erhalten.
EGPA Triton X hundert wurde nach 20 Messwerten hinzugefügt, wie der Ado zeigt, der ein minimales Signal erhält. Abbildung B zeigt das Verhältnis der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 340 Nanometern zu dem der Fluoreszenzemission nach Anregung bei 380 Nanometern. Diese Werte werden weiter in die Grynkiewicz-Gleichung eingefügt, um den intrazellulären Konzentrationscache zu erhalten.
Diese Abbildung zeigt die Charakterisierung eines repräsentativen Peptids zur Bestätigung der Sequenz und Reinheit. Abbildung A zeigt die vertikale Masse der repräsentativen Peptidsequenz WNK WAL war 857,90 Farbstoffverdünnung. Dies wird durch das Verhältnis N über Zed in der Massenspektroskopie gezeigt.
Abbildung B zeigt eine Peptidreinheit von 99%, wie durch HPLC bestätigt. Dieses Peptid gehört zur N+C-verkürzten Peptidbibliothek. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode einfach und vielseitig ist, die effizient und hell für das Calcium-basierte Screening der letzten Skala sein kann.
Es gibt jedoch mehrere Faktoren, die die Qualität der Daten bestimmen, und daher muss die Zusammensetzung für ein bestimmtes Zellinstrumentsystem optimiert werden. Vielen Dank.
