Diese Studien zielen darauf ab, robuste und reproduzierbare Modellsysteme bereitzustellen, um orientierungsspezifische Studien des Darmepithels durchzuführen. Apikale Organoide können in hoher Anzahl erzeugt werden und sind vielversprechend für ein Screening mit hohem Durchsatz. Monoschichten sind leichter zu manipulieren und bieten Zugang zu apikalen und basalen Zeichen.
Stellen Sie sicher, dass die Größe der Organoide 150 bis 250 Mikrometer im Durchmesser beträgt, bevor Sie mit dem Inversionsprotokoll beginnen. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig das Medium aus jeder Vertiefung, die Organoide enthält, ohne die ECM-Kuppel zu stören. Fügen Sie einen Milliliter eiskalte Dissoziationslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für eine Minute.
Entfernen Sie die Kuppeln vorsichtig, indem Sie langsam mit einer beschichteten Spitze pipettieren, wobei Sie darauf achten, die Organoide nicht zu stören und zu fragmentieren. Übertragen Sie die Organoidsuspension auf eine mit Antihaftlösung behandelte Platte und legen Sie die Platte 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Shaker. Nach 30 Minuten die Platte entfernen und die Lösung vorsichtig mit einer ein Milliliter Pipettenspitze, die mit Antihaftlösung beschichtet ist, auf und ab pipetten.
Legen Sie die Platte für weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius auf den Shaker. Entfernen Sie die Platte und lassen Sie die Organoide durch die Schwerkraft für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur absetzen. Nachdem sich die Organoide absetzen, entfernen Sie so viel wie möglich von der Dissoziationslösung und waschen Sie sie mit 1,5 Millilitern DMEM F-12.
Lassen Sie die Organoide sedimentieren und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dann die Wäsche. Entfernen Sie so viel DMEM F-12 wie möglich und fügen Sie 0,5 Milliliter Darmorganoid-Expansionsmedium hinzu.
Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Führen Sie am nächsten Tag eine teilweise Mediumsänderung durch, indem Sie die Platte in einem Winkel von 25 bis 30 Grad neigen und das Medium entlang der Wand des Brunnens entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass hängende Organoide nicht entfernt werden. Fügen Sie 0,4 Milliliter Darmorganoid-Expansionsmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Tage.
Wenn sich Aggregate gebildet haben, verwenden Sie eine ein Milliliter Pipettenspitze, die mit antihaftender Lösung beschichtet ist, um die Aggregate zu scheren, indem Sie 20 Mal auf und ab pipettieren, während Sie das Ende der Spitze auf den Boden der Platte drücken. Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmte 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, um Organoide wieder zu resuspendieren. Und gründlich mischen, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten.
Addieren Sie zu einem zusätzlichen Milliliter Trypsin-EDTA für eine große Anzahl von Zellen oder wenn eine signifikante Menge an ECM übrig bleibt. Bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten inkubieren und dann gründlich mit einer Ein-Milliliter-Pipette mischen, um die Organoide so zu stören, dass sie vollständig in einzelne Zellen oder kleine Fragmente dissoziiert sind. Um Fragmente oder ganze Organoide vollständig zu dissoziieren, setzen Sie die Inkubation mit Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für weitere drei bis fünf Minuten fort.
Sobald die Organoide ausreichend dissoziiert sind, fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM F-12 hinzu und pipetten Sie auf und ab, um gründlich zu mischen. Deaktivieren Sie das Trypsin-EDTA, indem Sie den Zellen 10% FBS hinzufügen. Zentrifugenfragmente bei 200 mal G für fünf Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius.
Wenn die dissoziierten Organoide es nicht schafften, die Zellen gründlich zu mischen, indem sie auf und ab pipettierten und sie wieder zentrifugierten. Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich. nur das Zellpellet bleibt.
Resuspend die Zellen in 100 Mikroliter darmorganoiden Differenzierungsmedium für jede zu säende Vertiefung. Anpassen der Lautstärke für größere oder kleinere Bohrbrunnengrößen. Entfernen Sie die beschichteten Platten aus dem Inkubator und entfernen Sie die überschüssige Basalmembranmatrixlösung aus jeder Vertiefung.
Fügen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in die obere Vertiefung jedes Zellkultureinsatzes und 500 Mikroliter intestinales Organoid-Differenzierungsmedium in die untere Vertiefung hinzu. Dann bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie das Medium sowohl in den oberen als auch in den unteren Vertiefungen alle zwei bis drei Tage.
Um eine ALI-Kultur zu etablieren, entfernen Sie das Medium aus den oberen und unteren Vertiefungen und fügen Sie dem unteren Brunnen frisches intestinales Organoid-Differenzierungsmedium hinzu, wobei der obere Brunnen leer bleibt. Die mit intestinalen Organoiden kultivierten intestinalen Organoid-Expansionsmedien zeigten eine zystische Morphologie. Wenn ECM entfernt wird, neigen einige Organoide dazu, sich in den ersten drei Tagen zu aggregieren und müssen durchgeknallt werden, um die Organoidzahl zu erhöhen.
Darmorganoide, die in ECM kultiviert wurden, dehnten sich weiter aus und zeigten eine spontane Bildung sekundärer Knospenstrukturen. Organoide, die fünf Tage lang in Abwesenheit einer extrazellulären Matrix aufrechterhalten wurden, zeigten längliche, zystische und unregelmäßige Formen. Die Expression atypischer Marker wie Villin und ZO-1 wurde auf der Außenseite des Epithels nachgewiesen, das dem Medium ausgesetzt war.
ECM eingebettete Organoide, die für Kerne, Villin und ZO-1 gefärbt waren und eine apikale Basalpolarität zeigten, bei der die apikale Seite dem Lumen des Organoids zugewandt war. Sobald die Monoschicht etabliert war, bildeten die Zellen Tight Junctions und eine konfluente Schicht. Die konfluente Schicht richtet auch ihren villinhaltigen Pinselrand auf die apikale Seite des Epithels aus und bildet zo-1-Multiproteinkomplexe zwischen den Zellen.
Der Übergang zu einer ALI-Kultur induzierte eine weitere Differenzierung mit prominenteren Speisebleszellen, die durch Färbung für das sezernierte Mucinprotein MUC2 visualisiert wurde Um die Polaritätsinversion zu induzieren, ist es wichtig, alle ECM zu entfernen, ohne die Organoide zu stören oder zu fragmentieren. Medienwechsel sollten auch mit Vorsicht durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass eines der suspendierten Organoide entfernt wird. Sicherzustellen, dass genügend Einzelzellen für die Etablierung der Monoschichtkultur vorhanden sind, ist ein wesentlicher Faktor für ihre Qualität.
Apikale spezifische Funktionen wie Nährstoffaufnahme oder Wirtspathogeninteraktionen können er nun in relevanten Systemen untersuchen, die den Bedürfnissen der Forscher entsprechen.
