Mit Ratten kann dieses Protokoll verwendet werden, um ein neues Modell der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV zu etablieren. Bei Ratten könnte die Etablierung des EcoHIV-Infektionsmodells für Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen für die Untersuchung von Neuro-HIV und HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen von Vorteil sein. Demonstrierende Vorgehensweise wird Hailong Li, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, sein.
Für die Verpackung des Virus in 293 T-Zellen fünfmal 10 bis fünf 293 T-Zellen pro Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS, in jeden der beiden gelatinebeschichteten 75-Quadratzentimeter-Kolben aussäen und die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Kulturen eine Konfluenz von 50% erreichen. Am Tag der Transfektion 22,5 Mikroliter Transfektionsreagenz in 750 Mikroliter Medium pro Kolben in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen und die Lösung drei Sekunden lang vortexen. 20 Mikrogramm der chimären EcoHIV-Plasmid-DNA in 750 Mikroliter Medium in einem zweiten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Kolben unter gründlicher Mischung verdünnen.
Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Transfektionsreagenz unter sanftem Mischen und inkubieren Sie die resultierende Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie jede Virussuspension zu 10 Millilitern vorwarmem DMEM-Medium hinzu und fügen Sie jede virusergänzte Lösung in einen Kolben mit 293 T-Zellen hinzu. Nach zwei Tagen Zellkultur den Überstand aus den Kolben in einem einzigen 50-Milliliter-Konikalrohr zur Zentrifugation bündeln und den geklärten Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführen.
Acht Milliliter Lenti-X-Konzentrator in den geklärten Überstand geben und mit sanfter Inversion mischen. Nach einer zweitägigen Inkubation bei vier Grad Celsius zentrifugieren Sie die Mischung und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, dann resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 100 Mikrolitern 100 Millimolar PBS und verwenden Sie ein P24 ELISA-Kit, um die Viruskonzentration zu titern. Für die EcoHIV-EGFP-Injektion rasieren Sie nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex die Haare aus der Gehirnregion und sterilisieren Sie die exponierte Haut zweimal mit 70% Ethanol und einem Peeling auf Chlorhexidinbasis.
Sichern Sie die Ratte in einer Bauchlage in einem stereotaxischen Apparat und machen Sie einen fünf bis sechs Zentimeter großen Schnitt durch die Haut entlang der Kopfhautmittellinie. Markieren Sie eine Bohrposition bei 0,8 Millimetern seitlich und eine 1,2 Millimeter rostrale bis bregma und bohren Sie an jeder Schädelposition ein Loch mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern. Laden Sie 1,04 mal 10 bis die sechsten Transduktionseinheiten pro Milliliter titerter EcoHIV Lentivirus-Lösung in eine 10-Mikroliter-Injektionsspritze und befestigen Sie die Spritze an der stereotaxischen Apparatur.
Bewegen Sie die Nadel nahe an die Oberfläche eines Bohrlochs und führen Sie die Nadel 2,5 Milliliter in das Loch ein. Infundieren Sie einen Mikroliter Viruslösung mit einer Rate von 0,2 Mikrolitern Virus pro Minute. Wenn das gesamte Virus injiziert wurde, lassen Sie die Nadel fünf Minuten lang im Injektionsbereich, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen, bis sie sich außerhalb des Rattenschädels befindet.
Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 4-0 Seidenfadennaht und sterilisieren Sie die Lösung mit 70% Ethanol, dann legen Sie die Ratte in eine Erholungskammer mit einem Heizkissen mit Überwachung bis zur Liege. Ein bis acht Wochen nach der Virusinfusion, nachdem eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt wurde, fixieren Sie die Ratte in Rückenlage in einem Abzug und schneiden Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Schneiden Sie die Membran ab, um die Brusthöhle zu öffnen, und führen Sie eine 20 Mal 25 Millimeter große Nadel in den linken Ventrikel ein.
Öffnen Sie sofort das rechte Atrium mit einer Schere und durchtränken Sie 50 Milliliter vorgekühltes 100 Millimolar PBS bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute. Wenn das gesamte PBS geliefert wurde, mit 100 Millilitern kaltem 4% Paraformaldehyd perfundieren. Wenn das gesamte Fixiermittel abgegeben wurde, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und fixieren Sie das Gewebe über Nacht in frischem 4% Paraformaldehyd.
Am nächsten Morgen legen Sie die Probe in 40 Milliliter 30% Saccharose in 100 Millimolar PBS in einem 50 Milliliter Röhrchen für etwa drei Tage, bis sich das Gehirn am Boden des Röhrchens absetzt, bevor Sie das Hirngewebe in Methylbutanol für zwei Minuten bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Verwenden Sie nach dem Einfrieren einen Minus 20 Grad Celsius Kryostaten und einen feinen Pinsel, um 50 Mikrometer dicke koronale Abschnitte zu erhalten. Wenn alle Abschnitte erhalten sind, decken Sie die Proben mit 300 Mikrolitern Anti-Fade-Medium ab und montieren Sie sie mit 22 50-Milliliter-Deckschichten.
Wenn das Medium getrocknet ist, stellen Sie die Schnitte durch konfokale Mikroskopie ab. Sieben Tage nach der Lentivirus-Injektion zeigen koronale Hirnschnittbilder von Ratten ein signifikantes Vorhandensein von EcoHIV-EGFP-Signalen im gesamten Hirngewebe, insbesondere im Kortex und im Gyrus hippocampus dentatus. Die duale Markierung mit Iba1- und EcoHIV-EGFP-Sonden liefert starke Beweise dafür, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp sind, der die EcoHIV-Expression im Gehirn beherbergt.
Acht Wochen nach der Infektion zeigen EcoHIV-injizierte Tiere eine relative Unempfindlichkeit gegenüber der Manipulation des Interstimulusintervalls, was durch eine relativ flachere Intervallfunktion im Vergleich zu Salzkontrollen belegt wird. Darüber hinaus zeigen EcoHIV-injizierte Ratten tiefgreifende Veränderungen in ihrer dendritischen Wirbelsäulenmorphologie, was durch eine erhöhte relative Häufigkeit kürzerer dendritischer Stacheln mit erhöhten Kopf- und Halsdurchmessern im Vergleich zu Kontrolltieren belegt wird. Die Konzentration und Titration des Konditionsmediums vor der stereotaxischen Injektion ist entscheidend, um die konsistenten und reproduzierbaren Ergebnisse über Experimente hinweg sicherzustellen.
Diese spezifische regionale stereotaxische Injektion von EcoHIV sorgt für eine effiziente HIV-Infektion im Gehirn und erzeugt bei Ratten zeitliche Verarbeitungsdefizite. Die Verwendung stereotaxischer HIV-Injektionen bei Ratten zur Erweiterung des EcoHIV-Infektionsmodells bietet eine wichtige Gelegenheit, neue Fragen im Zusammenhang mit Neuro-HIV zu beantworten.
