Das Protokoll zielt darauf ab, in vivo Bedingungen der Bandscheibendegeneration zu simulieren, um ihre Pathophysiologie ohne Tiermodelle zu untersuchen. Im Vergleich zur In-vitro-Zellkultur erhält die Bioreaktor-Organkulturtechnik die Zellen in ihrer nativen biologischen und biomechanischen mikroen Umgebung zusätzlich zur Versorgung mit einem kontrollierbaren und reproduzierbaren Kulturzustand. Beginnen Sie mit dem gründlichen Spülen des gesamten Rinderschwanzes mit Leitungswasser, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen, und tauchen Sie den Schwanz dann 10 Minuten lang in 1% Betadinlösung, um die Oberfläche zu desinfizieren.
Verwenden Sie ein Skalpell Nummer 20, um das Weichgewebe aus der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der Bandscheiben oder IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querprozesse der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange. Schneiden Sie quer mit einer Knochenzange durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um einzelne Bewegungssegmente zu erhalten, und legen Sie dann die gesammelten Bewegungssegmente in eine Petrischale mit einer Gaze, die in Ringers Lösung benetzt ist.
Lokalisieren Sie die IVD in Wirbeln, indem Sie die Bewegungssegmente sanft bewegen, und identifizieren Sie dann die Position der Wachstumsplatte, indem Sie die konvexe Seite der knöchernen Endplatte berühren und finden. Kühlen Sie die Klinge der Bandsäge mit Ringers Lösung ab und verwenden Sie sie, um zwei parallele Schnitte in der Wachstumsplatte der IVDs zu machen, einen auf jeder Seite. Die IVDs werden in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze überführen, die mit Ringers Lösung benetzt ist.
Kratzen Sie den Wirbelkörper und die Wachstumsplatte mit der Skalpellklinge ab und lassen Sie die Endplatte intakt. Positionieren Sie die beiden Oberflächen flach und parallel für den Ladevorgang und übertragen Sie abgekratzte IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist. Messen Sie die Bandscheibenhöhe und den Durchmesser mit einem Bremssattel und reinigen Sie dann die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit Ringers Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.
Desinfizieren Sie IVDs in PBS und 10% Penicillin Streptomycin mit Schütteln für 15 Minuten. Spülen Sie die hochkonzentrierten Antibiotika mit PBS und 1% Penicillin Streptomycin ab. Übertragen Sie die Scheiben in IVD-Kammern mit fünf Millilitern IVD-Kulturmedium und legen Sie sie mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 85% Luftfeuchtigkeit und 5% Kohlendioxid in das Bioreaktorsystem.
Kulturieren Sie die Scheiben vier Tage lang innerhalb eines Bioreaktorsystems, indem Sie je nach den Versuchsgruppen unterschiedliche Belastungsbedingungen aufrechterhalten. In der physiologischen Kontrollgruppe werden die IVDs mit hohem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,02 bis 0,2 Megapascal und 0,2 Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert. In der pathologischen Gruppe werden die IVDs mit niedrigem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,32 bis 0,5 Megapascal und fünf Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert.
Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit sieben Millilitern IVD-Kulturmedium, um die freie Quellung wiederhergestellt zu werden. Messen Sie die Scheibenhöhe täglich mit einem Bremssattel nach der freien Quellperiode und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer. Nach dem ersten dynamischen Ladezyklus am ersten Tag die IVDs direkt in eine Petrischale in vertikaler Position legen und mit einer Pinzette stabilisieren.
Injizieren Sie rekombinantes TNF-alpha mit einer 30-Gauge-Insulinnadel langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa 70 Mikrolitern pro Minute in die IVDs der pathologischen Gruppe. Ziehen Sie nach der Injektion die Spritze auf halbem Weg zurück und ziehen Sie den Kolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung ausläuft, und entfernen Sie dann die Spritze vollständig aus der IVD. Degenerative Belastung in Kombination mit begrenzter Nährstoffversorgung und einer TNF-alpha-Injektion führte nach vier Tagen Kultur zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression der entzündungsfördernden Marker Interleukin six und Interleukin acht im NP-Gewebe.
Die Freisetzung von Interleukin-Acht-Proteinen in das konditionierte Medium zeigte am zweiten und vierten Tag einen deutlichen Anstieg der pathologischen Gruppe. Die Verringerung der Bandscheibenhöhe nach belastung war in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur physiologischen Gruppe höher, und die Unterschiede waren nach den Tagen zwei und drei im Vergleich zum ersten Tag ausgeprägter, was auf eine fortschreitende Wirkung der degenerativen und entzündlichen Zustände hinweist. Eine standardisierte Dissektionstechnik ist wichtig für reproduzierbare IVD-Ganzorgankulturmodelle.
Ein Bioreaktor ist erforderlich, um physiologische und degenerative Belastungen auf IVDs anzuwenden, um verschiedene biomechanische In-vivo-Bedingungen zu simulieren. Diese Technik kann auf menschliche IVD-Explantierungen angewendet werden, was von hoher klinischer Relevanz ist. Es ist ein neuartiges präklinisches Modell zur Entwicklung wirksamer Behandlungen bei Bandscheibendegeneration im Frühstadium.
