Dieses Protokoll kombiniert Fluoreszenz-RNAscope-In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie unter Verwendung von frisch gefrorenen oder fixierten Gehirnpräparaten. Diese Technik ermöglicht Flexibilität durch die Demonstration einer Kombination aus hochempfindlicher In-situ-Hybridisierung und immunhistochemischen Methoden zur räumlichen Visualisierung von RNA- und Proteinzielen in derselben Gewebeprobe. Diese Methode ist für die Multiplex-Markierung in Hirngewebeschnitten anwendbar und hilft bei der Untersuchung der räumlichen Organisation und funktionellen Bedeutung von mRNA und Proteinen innerhalb heterogener neuronaler Populationen in den Neurowissenschaften.
Dieses Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Verarbeitungsschritte für frisch gefrorenes Gewebe und paraformaldehydfixiertes Gewebe. Um mit dem Schneiden des frisch gefrorenen Hirngewebes zu beginnen, befestigen Sie es auf dem vorgekühlten Kryostat-Chuck und schneiden Sie 14 Mikrometer dicke koronale Abschnitte. Montieren Sie die Sektion auf einem Objektträger aus geladenem Glas.
Übertragen Sie das montierte Dia in eine Diabox. Anschließend wird die Box auf Trockeneis in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius transportiert. Zur Gewebefixierung filtrieren Sie die vorbereitete Paraformaldehydlösung.
Auf 4 Grad Celsius abkühlen lassen. Bringen Sie den montierten Objektträger aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius auf Trockeneis und tauchen Sie ihn sofort für 15 Minuten in die vorgekühlte Paraformaldehydlösung. Führen Sie eine Dehydrierung des frisch gefrorenen Gewebes durch, um sicherzustellen, dass der Objektträger vollständig trocken ist. Nachdem das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom aus einer fixierten transkardialen Profusionshalterung entnommen wurde, wurden 30 Mikrometer dicke Gewebeschnitte geschnitten.
Bewahren Sie die geschnittenen Abschnitte in Kryoschutzlösung auf. Am Tag des FISH-Assays wird der frei schwebende Abschnitt in eine 12-Well-Zellkulturplatte mit 0,1 molaren PBS überführt und mit 90 bis 100 U/min auf einem rotierenden Plattformschüttler gerührt, um das Kryoprotektivum abzuwaschen. Befestigen Sie den Abschnitt dann mit einem Pinsel flach auf einem Objektträger für die Glasmikroskopie, um ein Ablösen beim Waschen zu verhindern, und lassen Sie ihn mindestens zwei Stunden lang an der Luft trocknen.
Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um den Abschnitt, um die FISH-Reagenzien aufzunehmen. Nach der Vorverarbeitung wird das Gewebe in Proteaselösung inkubiert und gemäß den Richtlinien des Herstellers zwei Stunden lang mit RNAscope-Sonden hybridisiert. Dann werden sequentielle Amplifikationsschritte und Fluoreszenz-Immunhistochemie durchgeführt.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer befeuchteten, lichtgeschützten Kammer für die Inkubation von Objektträgern. Im Wasserbad 50X Waschpuffer erwärmen und 10 Minuten lang auf 40 Grad Celsius erhitzen. Sobald es auf Raumtemperatur abgekühlt ist, bereiten Sie einen Liter 1-fachen Waschpuffer aus der 50-fachen Stammkonzentration vor.
Bereiten Sie die Sondenmischung wie im Textmanuskript beschrieben vor. Für die Proteinase-Behandlung geben Sie Proteinase 3 in den Gewebeschnitt und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Proteinase abzuwaschen, tauchen Sie den Objektträger vorsichtig in 0,1 molar PBS bei Raumtemperatur ein, um zu vermeiden, dass sich der Abschnitt löst.
Für die Hybridisierung wird die Sondenmischung in den Gewebeschnitt gegeben. Stellen Sie es in die befeuchtete, vorgewärmte Kammer. Anschließend zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren.
Spülen Sie den Gewebeschnitt zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer aus. Zur Signalverstärkung mit einer Tropfflasche eine Amplifikationslösung hinzufügen, um den Gewebeabschnitt abzudecken, und wie im Text beschrieben inkubieren. Geben Sie die Blockierungslösung auf den Gewebeschnitt und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
Schnippen Sie den Objektträger, um den überschüssigen Blockierungspuffer nach der Inkubation zu entfernen. Inkubieren Sie nun den Abschnitt mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Tag dreimal mit 1X TBS.
Fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. Erfassen Sie repräsentative Bilder mit 20-facher Vergrößerung und speichern Sie sie als TIF-Dateien.
In der vorliegenden Studie wurden die Gewebequalität, die Integrität und die Abwesenheit von bakterieller Kontamination durch das Fehlen einer DAPI-Markierung bestätigt. Die Markierung von Positivkontrollsonden, die auf Ubiquitin C, Peptidylprolylisomerase B und RNA-Polymerase IIA mRNA abzielen, bestätigte die RNA-Integrität. In frisch gefrorenen Präparaten zur Unterscheidung von GalR1-mRNA-positiven Neuronen innerhalb des NTS wurden zusätzliche neurochemische Marker verwendet.
Der membrangebundene vesikuläre Transporter war eindeutig markiert. Im Gegensatz dazu wurden zytoplasmatische Proteine wie Tyrosinhydroxylase und GFP, die unter der Kontrolle des PHOX2B-Promotors exprimiert wurden, schwach beobachtet und als flockig beschrieben, da ihnen eine klare Kontur fehlt. Die GalR1 FISH-Sondenmarkierung der zytoplasmatischen GalR1-mRNA war punktuell und konnte deutlich beobachtet werden.
Um zu bestätigen, dass die Qualität der Immunhistochemie von der subzellulären Lokalisation des Proteins abhängt, wurden verschiedene nukleäre und zytoplasmatische Proteine parallel zu FISH in denselben Gewebeschnitten markiert. Das zytoplasmatische PHOX2B GFP hatte ein flockendes Aussehen. Das nukleäre PHOX2B-Proteinsignal hingegen war eindeutig, was eine qualitativ hochwertigere Immunmarkierung in Kombination mit FISH bestätigte.
Bei der Durchführung an fixierten Schnellschnitten in Kombination mit FISH war die Immunhistochemie unabhängig von der subzellulären Lokalisation zuverlässig. GlyT2-mRNA-positive Neuronen befanden sich ventral des NTS und nicht innerhalb des NTS. GlyT2-mRNA-positive und PHOX2B-mRNA-positive Neuronen kolokalisierten nicht.
Eine Subpopulation von PHOX2B-mRNA-positiven NTS-Neuronen war Tyrosinhydroxylase-immunreaktiv, und keines enthielt GlyT2-mRNA. RNAscope ermöglicht die Visualisierung und Analyse der RNA-Verteilung mit Einzelmolekülauflösung in Zellen und Geweben. Es ermöglicht die Erforschung neuartiger RNA-Spezies, Krankheitsmechanismen, Genexpressionsmuster, Neuronenvielfalt und zellulärer Interaktionen.
