Diese Forschung wurde durch Stipendien des National Defense Medical College und durch ein Forschungsstipendium für Gesundheits- und Arbeitswissenschaften für die Erforschung hartnäckiger Krankheiten vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, Japan, unterstützt.

Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Research Committee des National Defense Medical College (Nr. 16058) genehmigt. Die Tiere wurden auf Standardlabor Chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan) gehalten. Die Labortiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt.
1. Sammlung und Trennung von Lymphozyten
HINWEIS: Da Lymphozyten frisch sein müssen und nicht gelagert werden können, müssen sie für jedes Experiment von Ratten gesammelt werden. Darüber hinaus müssen darm-tropische Lymphozyten direkt aus dem Brustkanal gesammelt werden, wo sie zirkulieren. Es wird erwartet, dass alle Eingriffe innerhalb von 6 Stunden abgeschlossen sein werden und alle Instrumente, Handschuhe und Oberflächen sauber sind. Um die Tiere in einem physiologisch stabilen Zustand zu halten, sollten alle im Experiment verwendeten Salz- und anderen Flüssigkeiten warm gehalten werden.
<ol><li>Bilden Sie ein Konservenrohr (1 mm Durchmesser) wie eine Heparinkurve (ein Radius von ca. 5 mm), nachdem Sie es in heißes Wasser (ca. 80–90 °C) eintauchen, und fixieren Sie es mit Klebeband für einige Stunden im Voraus an einer Kunststoffplatte.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie eine männliche Wistar-Ratte (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und schneiden Sie das Körperhaar des Bauches mit einem Haarschneider. Entfernen Sie das Haar fest nach der Rasur, so dass das Haar nicht in die Bauchhöhle.</li>
	<li>Nach der Bestätigung, dass die stabile Tiefe der Anästhesie für den Eingriff erforderlich ist, wird durch Zehenkneifen erhalten, machen Sie einen Schnitt mit chirurgischer Schere horizontal von der Mittellinie zum linken subcostalen Bereich. Achten Sie darauf, die Blutgefäße im parietalen Peritoneum nicht zu beschädigen, indem Sie die Gefäße unter Licht beobachten.</li>
	<li>Wickeln Sie den Magen mit nasser Gaze und bewegen Sie den Magen sanft nach rechts außerhalb des Körpers, um die retroperitonealen Organe zu offenbaren. Legen Sie eine Kerbe zwischen den Erector-Muskeln der Wirbelsäule und dem Fettgewebe mit chirurgischer Schere und trennen Sie sie unverblümt mit den Fingern.</li>
	<li>Das Bindegewebe um den Brustkanal vorsichtig abstreifen. Das überschüssige Bindegewebe nimmt mit dem Alter zu. Setzen Sie den Brustkanal direkt unter dem linken Krusten des Zwerchfells kauenal aus, bis eine Länge von 20 mm des Brustkanals sichtbar war. Mit Präzisionspinzette oder nassen Wattestäbchen trennen Sie die Adhäsionen zwischen Brustkorb und Aorta sanft.<ol>
<li>Führen Sie diesen Prozess sorgfältig durch, da einige Ratten Arteriolen haben, die sich von der Baucharterie verzweigen, die sich über den Brustkanal kreuzen, oder einen kurzen Brustkanal aufgrund einer höheren Position des Lymphplexus (kleine Thoraxkanäle, die sich wie Spinnennetze ausbreiten). Vermeiden Sie unnötigen Kontakt mit dem Brustkanal, um ödeme zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie eine Ligatur durch eine Schnur (3-0 Seide) auf den Brustkanal direkt unter dem linken Kruste des Zwerchfells auf. Der kaudale Thoraxkanal wird distended.</li>
	<li>Machen Sie ein Loch (5 mm Durchmesser) in der Bauchwand, indem Sie die Schneide der chirurgischen Schere stechen, das haargekrümmte Kanulationsrohr passieren und das Rohr an einer Stelle auf den Iliopsoas-Muskel legen. Füllen Sie das Cannulationsrohr mit normaler Salin, die 10 U/ml Heparin enthält.</li>
	<li>Nachdem Sie eine Schnur (3-0 Seide) unter den distended Thoraxkanal gesetzt haben, stechen Sie den Brustkanal mit der scharf geschnittenen Kante eines Kanulationsrohrs, können Sie ihn etwa 5 mm in Richtung des Schwanzes anbringen und den Brustkanal zur Fixierung mit einem Kanulationsrohr aufstellen.</li>
	<li>Um Die Saline zur Vermeidung von Austrocknung zu liefern, erstellen Sie ein Loch (3 mm Durchmesser) an der vorderen Wand des Magens mit präzisionspräziser Pinzette und übergeben Sie das Siliziumrohr (2 mm Durchmesser) durch den Pyloric-Ring an das Zwölffingerdarm. Nachdem Sie eine Wunde genäht und die Tiere in Bollmans Käfigen gehalten haben, beginnen Sie, zuckerhaltige Salzwäsche aus dem Siliziumrohr mit einer Durchflussrate von 3 ml/h in das Zwölffingerdarm jeder Ratte einzufließen. Bedecken Sie den gesamten Käfig mit einem Papiertuch, um ihn warm zu halten.</li>
	<li>Fixieren Sie das Konservenrohr am Loch in der Mitte des Deckels eines 50-ml-Koninusrohrs auf Eis, das 6 U/ml Heparin, 10% fetales Rinderserum und RPMI 1640 medium (pH 7.4; siehe Materialtabelle) enthält, und sammeln Sie thorakale Kanallymphozyten (TDLs) auf Eis. Achten Sie darauf, die Spitze des Rohres nicht an die Wand des konischen Rohres zu kontaktieren, um Kanülenrohrverschluss durch Fibringerbildung im Inneren des Rohres zu verhindern. Lymphflüssigkeit (ca. 20 ml) einschließlich ca. 1,0 x 108x 109 Lymphozyten kann in 6 Stunden erhalten werden. Um die Lymphozyten unter Vollständiger Anästhesie zu erhalten, wird die Anästhesieebene überwacht und der Lymphfluss entsprechend beobachtet. Die gleichen Anästhetika werden in der gleichen Dosis etwa 3 Stunden nach Ratten in Ballmans Käfig gesetzt, um tiefe Anästhesie kontinuierlich für 6 Stunden zu erhalten.</li>
</ol>2. Lymphozytenkennzeichnung mit Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFDSE)
<ol><li>CFDSE(Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 15,6 mM auflösen (500 g CFDSE gelöst in 60 l DMSO).</li>
	<li>Inkubieren Sie Lymphozyten (1 x 108x 109) in 50 ml RPMI 1640 mit 50 l CFDSE-Lösung für 30 min bei 37 °C, wie zuvor beschrieben10.</li>
</ol>3. Versuchsaufbau für mikrovaskuläre Studien
<ol><li>Anästhetisieren Empfängerratten (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und bestätigen die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifung. Befeuchten Sie den Bauch, bevor Sie das Fell pflegen, um die Haarkontamination zu minimieren. Öffnen Sie dann den Bauch des Empfängers Wister Ratte über einen Mittellinienschnitt.</li>
	<li>Legen Sie eine Ratte auf eine tragbare Edelstahlplatte (ca. 120 x 300 mm) mit einem Rechteckloch um die Mitte, das mit einem Glasschlitten (24 x 50 mm) bedeckt ist. Wählen Sie ca. 10 cm des Ileal-Segments einschließlich PPs zur Beobachtung.</li>
	<li>Den Darm so warm wie möglich und feucht mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 37 °C erwärmt halten. Einweichen Gaze, die verwendet wird, um den Dünndarm mit PBS zu bedecken.</li>
	<li>Während sie eine kontinuierliche Anästhesie mit 2 % Isofluran gibt (siehe Materialtabelle), stellen Sie das Dia auf die Bühne des Mikroskops und wählen Sie geeignete Bereiche für die Beobachtung der Mikrozirkulation in PPs, wo einige HEVs durch die Serosa verlaufen. PPs reichen in der Größe; größere eignen sich zur Beobachtung der Mikrozirkulation mit CLSM. Der Dünndarm ist stellenweise nicht gerade; ein gerades Segment von mindestens 2 cm Länge ohne Spannung ist zur Beobachtung geeignet.</li>
	<li>Bedecken Sie das angrenzende Darmsegment und die Mesentery mit saugfähiger Baumwolle, die mit PBS getränkt ist. Legen Sie das Darmsegment zwischen zwei gerollten Baumwollkugeln und positionieren Sie es so weit wie möglich vom Körper der Ratte, um zu verhindern, dass es durch den Herzschlag und die Atmung der Ratte vibriert.</li>
	<li>Mit einer 1 ml Spritze langsam (über 1 min) CFSE-markierte TDLs (1 x 108 Zellen) in die Jugularvene der Empfängerratten injizieren. Eine schnelle intravenöse Injektion kann die systemische Durchblutung beeinflussen.</li>
</ol>4. Mikrozirkulation von Lymphozyten
<ol><li>Kontinuierliche Überwachung von TDLs in der Mikrovaskulatur von PPs mit CLSM und Aufnahme auf einem Computer für 3 Stunden mit Zeitraffer-Fotografie in 30 s Intervallen. Die Tiefe von der Serosa bis zum HEV von PPs beträgt ca. 25 m, was die Beobachtung der Stroma- und Kapillarlymphgefäße bis zu einer Tiefe von 30 m ermöglicht.</li>
	<li>Injizieren Sie Texas Red-Dextran (25 mg/kg) in die Jugularvene jeder Empfängerratte, um den Blutkreislauf zu färben, und Hoechest 33342 (5 mg/kg), um die Zellkerne zu färben.</li>
	<li>(Optional) Um die Lymphozytendynamik zu quantifizieren, definieren Sie Lymphozyten, die an HEVs halten, mehr als 30 Sekunden als "klebende Lymphozyten" und Lymphozyten, die von HEVs zu Stroma auswandern, als "wandernde Lymphozyten". Berechnen Sie dann den durchschnittlichen Prozentsatz der Migration (wandernde Lymphozyten / klebende Lymphozyten + wandernde Lymphozyten) pro Sichtfeld (ca. 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. 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M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschrieben wir ein Protokoll zum Sammeln naiver Darm-Tropen-Lymphozyten und zur Beobachtung ihrer Migration in Ratten-PPs. Diese Verfahren können zeigen, wie sich Lymphozyten in der Mikrovaskulatur von PPs bewegen und es ermöglichen, ihre Dynamik unter einem normalen oder medikamentösen Zustand visuell zu vergleichen. Die direkte Beobachtung dieser Dynamik hat viel Verdienst, einen Hinweis auf eine immunologische Veränderung durch einige Medikamente zu erhalten, obwohl der Beobachtungszeitraum auf wenige Stunden begrenzt ist.
Wir haben einige Tipps in den Methoden erwähnt. Unter ihnen ist eines der heikelsten Verfahren, dass der Bediener den Brustkanal schnell und präzise anbringen muss. Wenn eine Operation lange dauert und unnötige Schäden mit sich bringt, treten signifikante Blutungen und Entzündungen auf, was zu einer verminderten TDL-Sammlung aufgrund von Ödemen des Bindegewebes und Obstruktion des Brustkanals führt. Früher haben wir das Rohr nach einem kleinen Schnitt am Brustkanal mit einer Schere mit einer kleinen Schneide kantül. Dieses Verfahren stört jedoch die Cannulationsstelle aufgrund der Entwässerung der Lymphe. Deshalb schneiden wir jetzt den Brustkorb nicht ab; vielmehr stechen wir es mit einer scharfen Kante. Diese Methode erleichtert die Cannulation und erhöht die Erfolgsraten. Darüber hinaus ist die Einschnittstelle im Brustkanal aufgrund der begrenzten Bauchhöhle sehr wichtig. Wenn die Einschnittstelle zu nah an der Membran liegt, würde der gekrümmte Teil des Kanulationsrohrs gegen das Zwerchfell stoßen. Wenn es zu weit von der Membran entfernt ist, ist es auch schwierig, das Rohr tief genug zu zerlegen, um eine Fixierung aufgrund des Lymphplexus des kaudalen Brustkanals zu gewährleisten. Selbst bei guter Konserve kann das Konservenrohr durch Fibrinbildung leicht verstopft werden. Daher empfehlen wir, das Rohr regelmäßig sanft mit Heparin zu spülen.
Jüngste Fortschritte im BEREICH CLSM ermöglichten es, den fokussierten Bereich im Vergleich zu einer früheren Studie11deutlicher und präziser in Echtzeit zu beobachten. Wir verwenden CLSM jetzt in unserem Labor, aber wir können die Mikrozirkulation mit einem Multiphotonenmikroskop genauer beobachten. Obwohl das Protokoll eine Änderung in mehreren Punkten zusammen mit dem technischen Fortschritt erfordert, ermöglicht es die Beobachtung des lokalisierten Bereichs des Interessenorgans12,13.
Der Verdienst und Der Schlüssel der Methode besteht darin, Lymphozyten von Empfängertieren zu trennen, sie mit jeder Art von Verbindungen in vitro zu bebrüten und sie nach ihrer Injektion in Empfängertiere zu beobachten. Dies macht es möglich, die Auswirkungen von Lymphozyten allein zu klären. Im Gegenteil, wenn wir die Auswirkungen jeglicher Art von Verbindungen auf andere Zellen als Lymphozyten, wie das vaskuläre Endothel, aufklären wollen, können wir Empfängertiere mit jeder Art von Verbindungen behandeln und sie nach der Injektion von Kontrolllymphozyten beobachten. Um die gleichen Dinge mit Mäusen aufzuklären, müssen wir bedingte genetisch manipulierte Tiere nacheinander schaffen. Darüber hinaus würde die Sortierung der isolierten Lymphozyten mit Hilfe eines bestimmten Oberflächenmarkers es ermöglichen, die Dynamik bestimmter Arten von Lymphozyten zu untersuchen.
Wie im Video dieser Studie gezeigt, bewegen sich Lymphozyten auf unbestimmte Zeit und seitlich durch das vaskuläre Endothel des eigentlichen Körpers, so dass es schwierig ist, Effekte auf ihr Verhalten nur mit In-vivo-Beobachtungen zu bewerten. Wenn der Wirkmechanismus eines verabreichten Arzneimittels untersucht werden soll, ist er ursprünglich für die Untersuchung jedes Wirkungsortes ungeeignet. Der Verdienst dieser Studie ist, dass durch die Trennung von Lymphozyten und deren Inkubation in vitro die medizinischen Wirkungen getrennt auf der Gefäß- und Lymphozytenseite untersucht werden können. Weniger Variablen sind einfacher zu analysieren.

Peyers Pflaster (PPs) bestehen aus Hunderten von Lymphfollikel in der Lamina propria des Dünndarms. PPs sind in Follikel, die interfollikuläre Region und Keimzentren im unteren Teil der Follikel unterteilt, wo Lymphozyten durch Antigen-Präsentation stimuliert werden. Es gibt keine afferenten Lymphgefäße, und die Antigene dringen über die Epithelzellschicht aus dem Darmlumen in die Lamina propria ein. Die epitheliale Region, die Lymphfollikel bedeckt, wird follikelassoziiertes Epithel genannt, in dem spezialisierte interspersierte M-Zellen Schleimhautantigene aufnehmen. M-Zellen nehmen Antigene von der luminalen Seite auf und Antigene werden dann von dendritischen Zellen eingefangen und in Richtung naiver Lymphozyten präsentiert, die durch das Endothel von hohen endothelialen Venulen (HEVs)inPPs fließen. PPs spielen eine wichtige Rolle bei der Darmimmunität und sind mit dem frühen Stadium der Entzündung verbunden. Viele molekulare Wechselwirkungen beinhalten den Eintritt von Lymphozyten zu sekundären Lymphorganen (SLOs), einschließlich Adhäsionsmoleküle, Chemokine2,3und Sphingosin-1-Phosphat4; Daher gibt es viele erwartete therapeutische Ziele. Daher ermöglicht die Beobachtung der Lymphozytendynamik innerhalb von PPs, einen Einblick in das sehr frühe Stadium der Entzündung zu erhaschen und die Nützlichkeit mehrerer vielversprechender Medikamente zu untersuchen.
Die Methode konzentriert sich hier auf die Migration von Lymphozyten in PPs, die mehrere Verfahren umfasst (Kannulation in den Brustkanal5 und Das Sammeln von Lymphozyten und Langzeitbeobachtung nach der Injektion in gesammelte Lymphozyten). Da diese Verfahren komplex sind und es schwierig war, genau zu sehen, wie jedes Verfahren in früheren Berichten durchgeführt wurde, haben wir hier einige Tipps erwähnt, um eine erfolgreiche Beobachtung zu erreichen. Zum Beispiel war die Cannulation der Rohre in den Brustkanal sehr schwierig, und die anfängliche Erfolgsrate der Cannulation betrug weniger als 50%. Wir haben die Methode jedoch verbessert und eine Erfolgsquote von über 80 % erzielt. Wir haben einige weitere Tipps in diesem Manuskript erwähnt, die für die erfolgreiche Beobachtung notwendig sind, um die quantitative Auswertung der transendotheliale Migration von Lymphozyten unter verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
In früheren Berichten war es schwierig, die dreidimensionalen Veränderungen im Laufe der Zeit zu verstehen, wie die intravenöse Injektion von Indientinte, um die Gefäßstruktur von PPs6zu färben, oder das Mikroskop ist monofokal7. In den letzten Jahren hat eine Beobachtungsmethode mit einigen photoconvertiblefluoreszenzproteintransgenen Tieren wie Kaede-Mäusen systematische zelluläre Bewegungen in vivo8geklärt. Die andere Studie verdeutlichte CD69 unabhängige Abschaltung von Lymphozyten austritt aus PPs9. Wir verwendeten konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) wegen seiner hohen Analysefähigkeit. Jetzt können wir leicht hochauflösende Bilder erhalten und sie verwenden, um die Lymphozytendynamik zu analysieren.
In diesem Bericht haben wir eine Reihe von Methoden zur Bewertung der Lymphozytenmigration in PPs demonstriert. Zuerst zeigten wir raffinierte Methoden der thorakalen Kanalkannulation, um Lymphozyten zu sammeln. Zweitens haben wir die Beobachtungsmethoden auf verschiedene Weise verbessert, um objektive Organe nach Möglichkeit unter mikroskopischer Beobachtung zu erhalten, so dass wir 3 Stunden lang qualitativ hochwertige Bilder erhalten können. Drittens quantifizierten wir die zellulären Bewegungen der Lymphozytenmigration, um die Auswirkungen einiger Medikamente zu bewerten. Diese geänderten Protokolle werden zur Entwicklung von Mukosal-Immunologie-Evaluierungen beitragen.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Naive Lymphozyten zirkulieren unter physiologischem Zustand aus dem Blut in das Lymphgewebe und es wird allgemein als ein wichtiges Phänomen in der Darmimmunität anerkannt. Die Stroma von sekundären Lymphorganen, wie Peyers Pflaster (PPs) oder mesenterischen Lymphknoten, sind, wo naive Lymphozyten Antigene spüren. Naive Lymphozyten zirkulieren durch den Blutkreislauf, um hohe endotheliale Venules zu erreichen, das Portal des Eintritts in PPs. Es wird geschätzt, dass einige Immunmodulatoren die Lymphozytenmigration beeinflussen, aber die genaue Bewertung der Mikrozirkulationsdynamik ist sehr schwierig, und die Festlegung einer Methode zur Beobachtung der Lymphozytenmigration in vivo kann zur Klärung der genauen Mechanismen beitragen. Wir verfeinerten die Methode, Lymphozyten aus dem Lymphkanal zu sammeln und die detaillierte Dynamik von Darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-PPs zu beobachten. Wir haben uns für die konfokale Laserscanmikroskopie entschieden, um Ratten-PPs in vivo zu beobachten und sie mit Zeitrafferfotografie aufzuzeichnen. Wir können jetzt klare Bilder erhalten, die zur Analyse der Lymphozytendynamik beitragen können.

Sammeln von Lymphozyten aus Lymphe Um die Ratte auf die Thoraxkanalkannulation vorzubereiten, machen Sie einen Schnitt in den angespannten Brustkanal, wie in Abbildung 1 dargestellt, und halten Sie die Ratte dann in einem Bollman-Käfig, wie in Abbildung 2dargestellt.
Wenn die Lymphozyten gut gesammelt sind, können wir etwa 20 ml/6 h Lymphflüssigkeit mit etwa 107x 108/mL Lymphozyten erhalten. Von den TDLs drücken 70% CD4 aus, darunter etwa 90% Zellen, die CD62L exprimieren, was die Hauptzusammensetzung von TDLs (>60%) bedeutet. besteht aus naiven Darm-tropischen Lymphozyten. Da es sich bei den hier gesammelten Lymphozyten um Zellen handelt, die gezielt in den Darmtrakt wandern, eignen sie sich zur Beurteilung des Migrationszustands in Peyers Pflastern.
Mikroskopische Beobachtung Nach der Injektion einer ausreichenden Dosis von fluoreszierenden Lymphozyten, montieren Sie den Darm der Empfängerratte auf einem Glasschlitten, wie in Abbildung 3dargestellt. Abbildung 4zeigt ein mikroskopisches Bild von PPs im physiologischen Zustand.
Für die Mikrobeobachtung können Ratten unter Laparotomie etwa 3 Stunden lang stabil anbeet werden. Lymphozyten haften an HEVs, rollen und wandern in die umliegenden Stroma und wandern dann zu Lymphkapillaren. Wir quantifizierten und bewerteten den Prozentsatz der Lymphozyten, die innerhalb des Beobachtungszeitraums in der Stroma wanderten.
Nach der Injektion einer ausreichenden Dosis fluoreszierender Lymphozyten beginnen darm-tropische Lymphozyten an HEVs zu haften und wandern in etwa 1 Stunde über das Endothel in die Stroma. Die meisten bewegen sich innerhalb der Stroma, während andere in etwa 2–3 Stunden zu Lymphkapillaren wandern. Die gut entwickelte Fluoreszenzkennzeichnung ex vivo in dieser Studie führte zu einer hohen Intensität und ermöglicht es uns, die Lymphozytendynamik sehr tiefer Fläche zu beobachten. Darüber hinaus können wir durch die Verwendung einer anderen Art von Fluoreszenzkennzeichnung die Dynamik verschiedener Lymphozytenarten gleichzeitig leicht beobachten. Diese Darm-tropische Lymphozytenmigration kann visuell für die Unterdrückung durch einige Immunmodulatoren wie FTY720 geklärt werden, wie in unserem vorherigen Bericht gezeigt.
Die Beobachtung des Mikrokreislaufsystems selbst ist äußerst schwierig, und es ist wünschenswert, eine einfache Bewertungsmethode festzulegen. Diese Studie hat es auch möglich gemacht, herauszufinden, wo die Aktionsstelle des Medikaments in den Peyer-Pflastern ist. Insbesondere die Ex-vivo-Verabreichung von FTY720 an Lymphozyten ermöglichte es, die Wirkungsstelle nur auf Lymphozyten, aber nicht auf Endothel zu beschränken. In Kombination mit der Sortierung spezifischer Lymphozyten würden detailliertere Ergebnisse erzielt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig1.jpg"> Abbildung 1: Verfahren zur Belichtung des Brustkanals und zur Cannulation. Nach dem Schneiden des Peritoneums längs kann der Brustkanal freigelegt werden, indem der Magen kranially bewegt und das Bindegewebe auf der dorsalen rechten Seite der Bauchaorta seziert wird. Das Bindegewebe um das Zwerchfell sollte sorgfältig seziert werden, um Verletzungen zu verhindern. Der Brustkanal sollte so breit wie möglich cranially ausgesetzt werden, um genügend Platz für die Cannulation zu schaffen und dann durch eine 3-0 Seidennaht knapp unter dem Zwerchfell ligiert werden, um den Lymphfluss zu stoppen und die Flüssigkeit kauarisch zu halten. Milchige Lymphflüssigkeit ist durch den Lymphkanal sichtbar, wo der Katheter eingesetzt werden kann. Der Brustkanal der Ratte sollte leicht belastet sein, um eine glatte Cannulation zu gewährleisten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig2.jpg"> Abbildung 2: Ein Bild der gesamten Einstellung zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten (TDLs). Die Ratten werden in Bollmans Käfigen gehalten und TDLs werden durch das Cannulationsrohr in jede Durchstechflasche gesammelt. Die Fläschchen werden auf Eis gesetzt und alle 12 Stunden ersetzt, um frische Lymphflüssigkeit zu sammeln. Zuckerhaltige Salzsäure wird durch ein Silikonrohr mit einer Spritzenpumpe mit einer Rate von etwa 3 ml/h verabreicht, um Austrocknung zu verhindern. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig3.jpg"> Abbildung 3: Die Ratte wird auf die Bühne des Mikroskops gestellt, die mit der Anästhesiemaschine verbunden ist, und eine fluoreszierende Substanz oder fluoreszierend markierte Lymphozyten werden aus dem Venenkatheter durch die innere Jugularvene (A) injiziert. Der Beobachtungsbereich des Darmtraktes wurde sanft zwischen zwei gerollten Baumwollkugeln fixiert. Der Darmtrakt wurde weit vom Rumpf entfernt befestigt, um Vibrationen durch Atembewegungen zu vermeiden. Gerollte Baumwollkugeln wurden in Phosphat gepufferte Kochchen eingeweicht, um eine Austrocknung des Darms während des Beobachtungszeitraums zu verhindern (B). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig4.jpg"> Abbildung 4: Mikroskopisches Bild von Peyers Flecken im physiologischen Zustand (A). Die Kerne der vaskulären Endothelzellen sind blau gefärbt. Das Blutplasma ist rot, und der Blutfluss wird durch den Fluss von ungefärbten Zellen erkannt. Gut-tropische Lymphozyten (grün gefärbt) an hohen endotheliale Venulen (B). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.

Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Aufrufe.  National Defense Medical College. Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.

Serie: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Krebsforschung

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Traktionskraftmikroskopie zur Untersuchung der B-Lymphozytenaktivierung

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Biotechnik

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Biologie

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolierung von Lymphozyten aus einem Peyer-Pflaster der Maus

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...