Die Vorbereitung einer Einzelzell- oder Einzelkernsuspension ist ein entscheidender Schritt für Transkriptom und Epigenomprofilierung mit hohem Durchsatz. Unser Protokoll bietet eine einfache, reproduzierbare und universelle Methode zur Isolierung einzelner Kerne. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die Waschmittel für die Kernisolierung erfordern, ist unser Protokoll säulenbasiert, was waschmittel- und enzymfrei ist.
Es ermöglicht die Isolierung der Kerne in weniger als 30 Minuten. Unser Protokoll vereinfacht die Isolierung von Kernen. Es bietet eine robuste Methode, um einzelne Kerne Suspension aus schwer zu dissoziieren dem Gewebe vorzubereiten.
Zunächst puffern A und B aus einem waschmittelfreien Kernisolierungskit, indem man sie mindestens 30 Minuten auf Eis legt. Mantelrohre und Pipettenspitzen mit 5%BSA-Lösung, die die Rückgewinnung der Kerne verbessern wird. Um die Pipettenspitzen zu beschichten, Pipette 5%BSA Lösung zwei bis drei Mal und Luft trocknen sie für zwei Stunden.
Um die Rohre zu beschichten, füllen Sie sie mit BSA und kehren Sie sie dreimal um. Entfernen Sie die Lösung und trocknen Sie die Rohre zwei Stunden lang auf einem sauberen Tissuepapier auf den Kopf. Mantel ein Sammelrohr und ein 1,5 Milliliter Rohr pro Probe.
Verwenden Sie Zangen, um den Schädel sanft aufzubrechen und Weichgewebe, Haut und Knochen von den ventralen und dorsalen Seiten des Schädels zu entfernen. Dann übertragen Sie das Gehirn vorsichtig in eine 30-Millimeter-Schale mit eiskaltem PBS und zerkleinern Sie das Gehirn mit einer Rasierklinge in kleine Stücke. Um einzelne Kerne zu isolieren, übertragen Sie das Hackfleisch auf die im Kernisolationskit vorgesehene Filterpatrone und entfernen Sie überschüssige Lösung und fügen Sie 200 Mikroliter Kaltpuffer A.Grind das Gewebe mit einer Kunststoffstange für zwei Minuten hinzu.
Fügen Sie 300 Mikroliter Kaltpuffer A in die Filterpatrone und inkubieren Sie sie auf Eis mit der Kappe für 10 Minuten geöffnet. Dann die Patrone kappen und das Gewebe wieder aufhängen, indem Sie das Rohr fünfmal invertieren. Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen 30 Sekunden lang mit 16.000 mal g, um die Zellen zu brechen.
Der Durchfluss enthält intakte Kerne, die ein farbloses Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Entsorgen Sie den Filter und setzen Sie das Pellet dann wieder auf, indem Sie 10 Sekunden lang kräftig wirbeln. Pellet die Kerne wieder durch Zentrifugieren der Lösung bei 500 mal g für drei Minuten.
Dann den Überstand vorsichtig entsorgen. Setzen Sie das Pellet in 0,8 Milliliter Kaltpuffer B wieder auf, indem Sie zwei- bis dreimal pipetieren und die Kerne 10 Minuten lang bei 600 mal g zentrifugieren, wodurch sie vom Membranabfall getrennt werden. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
Setzen Sie die isolierten Kerne in 500 Mikroliter PBS mit 5%BSA aus und halten Sie die Suspension bis FACS auf Eis. Um die Kernmorphologie mit HEX-Färbung zu bestätigen, übertragen Sie 100 Mikroliter der Einzelkernsuspension mit den BSA-beschichteten Spitzen in ein neues Rohr. Färben Sie die Kerne, indem Sie 0,1 Mikroliter HEX hinzufügen und das Rohr sanft wirbeln.
Übertragen Sie die Kernaufhängung mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Laseranregungseinstellung von 405 Nanometern auf eine Glasbodenschale und ein Bild der Kerne. Vor der Durchführung von FACS die Kerne mit einem 40-Mikrometer-Zellsieb in ein BSA-beschichtetes Rohr filtern. Verdünnen Sie die gefilterte Suspension, indem Sie PBS mit 5%BSA zu einem Endvolumen von 1.000 Mikrolitern hinzufügen.
Beschriften Sie zwei runde FACS-Rohre als Steuer- und Gebeizid und übertragen Sie 250 Mikroliter der Kernsuspension mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze in das Steuerrohr. Übertragen Sie die restlichen 750 Mikroliter der Lösung in das FACS-Rohr, das mit Derart gekennzeichnet ist, und fügen Sie einen Mikroliter HEX-Farbstoff hinzu, um die Kerne zu färben. Dann mischen Sie es durch langsames Wirbeln.
Laden Sie die unbefleckte Steuerprobe in den Zellsortierer, und zeichnen Sie 5 000 Ereignisse auf. Laden Sie dann die gebeizte Probe und zeichnen Sie 5 000 Ereignisse auf. Zeichnen Sie FACS-Gates zur Identifizierung einzelner Kerne.
Kerne können durch den Vergleich des HEX-Fluoreszenzsignals zwischen der Steuerung und den gebeizten Proben ausgewählt werden. Sortieren Sie dann HEX-positive Kerne aus dem gebeizten Rohr in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr mit 50 Mikroliter PBS mit 5%BSA. Dieses Protokoll wurde verwendet, um einzelne Kernsuspension direkt aus Zebrafisch Gehirngewebe zu erzeugen.
Die isolierten Kerne wurden mit HEX befleckt und mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Sie wirkten intakt, rund und gut getrennt. Wichtig ist, dass die nukleare Aggregation fehlte.
Die Anreicherung isolierter Kerne wurde mit Durchflusszytometrie durchgeführt, indem das Vorhandensein eines HEX-Fluoreszenzsignals gegatingt wurde. Ungefärbte Kerne zeigten Hintergrundfluoreszenz, während gefärbte Kerne ein starkes Fluoreszenzsignal zeigten. Die ungefärbten und gebeizten Kerne waren im violetten Kanal gut getrennt.
Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass einzelne Kerne dazu neigen, auf einem Kunststoffmaterial zu kleben. Um den potenziellen Verlust von Kernen zu verhindern und die Effizienz zu erhöhen, wird eine Grundbeschichtung des Kunststoffmaterials dringend empfohlen. Isolierte Einzelkernsuspensionen können weiter für einzelne Kerne RNA genutzt werden Diese Technik erhellt die zelluläre Heterogenität in komplexen biologischen Systemen und hilft, Zellsubtypen und Gennetzwerke zu definieren.
Mit hilfe einer waschmittel- und enzymfreien Methode werden die bei der Probenvorbereitung eingeführten technischen Geräusche und Verzerrungen registriert. Diese Methode hat eine vereinfachte und logistische Isolation einzelner Kerne entwickelt.
