Dies ist die robusteste und empfindlichste Methode zur Beurteilung der Geruchsempfindlichkeit bei Meeresfischen, da sie ein rein sensorisches Signal vor jeder Verarbeitung durch das ZNS aufzeichnet. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre Empfindlichkeit und dass sie leicht auf eine andere Art aus einer anderen Umgebung übertragen werden kann, unabhängig von externem Salzgehalt. Um das Kontrollwasser vorzubereiten, sammeln Sie einen Liter mit Holzkohle gefiltertem Meerwasser und verwenden Sie eine pH-Sonde, um den pH-Wert zu überprüfen.
Der pH-Wert sollte etwa 8,2 betragen. Ist dies nicht der Fall, blasen Sie das Meerwasser mit atmosphärischer Luft, bis ein pH-Wert von 8,2 erreicht ist. Als Nächstes verwenden Sie einen Alkalinitätstitrator, um die Alkalinität des Wassers zu messen, und messen Sie dann die Wassertemperatur und den Salzgehalt.
Um hochkohlendioxidhaltiges Wasser zuzubereiten, filtern Sie einen Liter Meerwasser durch Partikel-Inaktivkohlefilter, bevor Sie mit Kohlendioxid sprudeln, bis der gewünschte pH-Wert erreicht ist. Verwenden Sie eine pH-Sonde, um den pH-Wert zu überprüfen, der um 7,7 sein sollte, und verwenden Sie dann einen Alkalinitätstitrator, um die Alkalinität des Wassers zu messen und die Wassertemperatur und den Salzgehalt zu messen. Um den Kohlendioxiddruck sowohl in der Steuerung als auch in hohem Kohlendioxidwasser zu bestimmen, öffnen Sie ein Softwareprogramm, das entwickelt wurde, um Kohlendioxidparameter in Wasser zu berechnen und den Wassersalzgehalt, die Temperatur, den Druck, die Gesamtalkalinität und den pH-Wert in das Eingangsfenster einzutragen.
Wählen Sie dann die Konstanten, Skalen und Einheiten aus, und klicken Sie auf den Prozess, um den Kohlendioxiddruck zu bestimmen. Nachdem Sie eine angemessene Sedierung durch mangelnde Reaktion auf Schwanzkneifen bestätigt haben, legen Sie den anästhesierten Fisch auf eine für das Modell angepasste Kissenstütze und legen Sie ein entsprechend großes Siliziumrohr in den Mund des Fisches. Das Rohr ist mit einer Tauchpumpe verbunden und ein Reservoir von Anästhetikum, das lufthaltiges Meerwasser enthält und Wasser wird in einer Rate von etwa 100 Milliliter pro Minute pro Kilogramm über die Kiemen gepumpt.
Als nächstes legen Sie einen Erdungsstift in den Flankenmuskel ein und schließen Sie den Stift an die Kopfstufe des Verstärkers an. Bedecken Sie den Fisch mit einem feuchten Tuch, wobei nur der Kopf freigelegt ist, und positionieren Sie das Rohr mit dem Stimulus-Liefersystem innerhalb des Nasenlochs. Um die riechigen Nerven freizulegen, verwenden Sie einen Bohrer und ein Sezieren mikroskop, um die Haut und den Knochen des Schädels zwischen den Augen zu entfernen.
Wenn Sie eine Seebrassen verwenden, verwenden Sie eine Kreissäge, um den Teil des Schädels direkt über den Augen zu entfernen, um nur nach der Seite der Augen und verwenden Sie den Bohrer, um den Knochen zwischen den Augen zu entfernen. Sobald genügend Knochen gelöscht wurde, verwenden Sie feine Zange, um das Fett und Bindegewebe über die riechliegenden Nerven zu entfernen, ohne die Nerven oder Gefäße zu beschädigen. Reinigen Sie die Elektroden vor der Verwendung, indem Sie sie an den negativen Pol einer Gleichstromquelle mit drei Volt anschließen und die Spitze 20 bis 30 Sekunden lang in physiologische reine Salzlinie legen.
Ein stetiger Strom von kleinen Blasen sollte von der Spitze kommen gesehen werden. Verbinden Sie parylenbeschichtete Wolframelektroden mit der Kopfstufe eines Wechselstrom-AC-Vorverstärkers. Sobald die Riefaktor-Nerven exponiert wurden, verwenden Sie Mikromanipulatoren, um die Elektroden in den entsprechenden Riechnerv in einer Position einzufügen, die eine maximale Reaktion auf den Standard und eine minimale Reaktion auf den Rohling gibt.
Vorausgesetzt, die Sezierung verläuft reibungslos, der entscheidende Schritt ist es, die Elektroden in die richtige Position zu bringen. Dies kann Einigezeit in Anspruch nehmen und erfordert ein gewisses Maß an Versuch und Irrtum. Um elektrophysiologische Messwerte zu erhalten, verwenden Sie ein magnetisch betriebenes Drei-Wege-Ventil, um ein Stimulus-Liefersystem einzurichten, um das schnelle Umschalten von sauberem Hintergrundwasser zu Stimulus enthaltendem Wasser zu ermöglichen und den gemeinsamen Auslass an das Rohr anzuschließen, das Wasser mit der olfaktorischen Rosette transportiert.
Legen Sie eine Linie im Hintergrund Meerwasser und die andere in der Testlösung. Schließen Sie den Ventiltreiber an den Auslöser eines analogen Digitalwandlers an und konfigurieren Sie die Software so, dass die Aufzeichnung am Triggerereignis beginnt und für einen vorher festgelegten Zeitraum fortgesetzt wird. Um die Stabilität des Präparats zu überprüfen, können Sie die Amplitude des integrierten Ansprechens wiederholt aufzeichnen und messen, wobei die Norm eine Minute zwischen aufeinanderfolgenden Reizen verstreichen lässt.
Als nächstes erfassen Sie die geruchsriechen Nervenreaktionen auf Aminosäuren im kontrollierten Meerwasser, und lassen Sie eine Minute zwischen aufeinanderfolgenden Reizen vergehen, und notieren Sie dann die Reaktion auf ein mal 10 auf die negative dritte Molar-Serin in einer Kontrollwasser-Rohlösung. Dann erfassen Sie die olfaktorischen Nervenreaktionen auf Aminosäuren in hohem Kohlendioxid-Meerwasser. Die Reaktion auf eine hohe Kohlendioxid-Wasser-Rohlösung und die Reaktion auf ein mal 10 auf die negative dritte Molaren-Serine in einer Kontrollwasser-Rohlingslösung.
Hier werden typische Reaktionen auf positive und negative Kontrollreize gezeigt, die vom Riefaktornerv einer Seebrassen aufgezeichnet wurden. Innerhalb von etwa einer Sekunde der Stimulusanwendung kann ein rascher Anstieg der Aktivität beobachtet werden, gefolgt von einer Periode der Anpassung, während der Stimulus noch vorhanden ist, und einer Rückkehr zur Basisaktivität, sobald der Stimulus beendet ist. Im Gegensatz dazu ruft ein leerer Stimulus wenig oder gar keine Reaktion hervor.
In dieser typischen Konzentrationsreaktionskurve kann beobachtet werden, dass steigende Konzentrationen eines Geruchsstoffes zu einem immer größeren Anstieg der Aktivität und damit amplitude der integrierten Reaktionen führen können. Die Darstellung der normalisierten Daten und die entsprechende lineare Regression ermöglicht die Abschätzung des Nachweisschwellenwerts für die Konzentrationsreaktionen jedes Tieres oder einer Gruppe von Tieren. Sigmoidal Konzentrationsreaktionskurven können halblogarithmisch dargestellt werden, was eine Berechnung der Geruchskonzentration ermöglicht, die bei einer maximalen Reaktion von 50% evoziert.
Es ist wichtig, die Fische so gesund wie möglich zu halten. Stellen Sie beispielsweise sicher, dass die Kiemen ausreichend bewässert sind und dass das olfaktorische Epithel während der Aufnahme nass gehalten wird. Eines unserer Ziele ist es, die neuronalen Bahnen im Gehirn bis zu dem Ort zu verfolgen, an dem die sensorischen Informationen weitergeleitet werden.
