Unser Protokoll beschreibt die Verwendung herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe für die superhochauflösende Mikroskopie mit ihren spärlichen, rot verschiebten Zuständen. So können wir Organellen und Biomoleküle in lebenden Zellen mit einer Auflösung von 30 Nanometern untersuchen. Der Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit und die Vielseitigkeit verschiedener verfügbarer BODIPY-Konjugate, die eine langanhaltende Quelle für einzelne Molekülsignale bieten.
Unsere nachgewiesene Anwendung könnte wichtig werden, um Erkenntnisse über Krankheiten wie Fettlebererkrankungen oder Typ-2-Diabetes zu gewinnen, indem Lipidtröpfchen und Fettsäure unterhalb der Beugungsgrenze gelöst werden. Wir gewinnen Einblicke in die Fettsäure- und Lipidtröpfchenbiologie in Hefe- und Säugetierzellen. Diese Technik ist jedoch auf alle anderen transparenten Zelltypen mit geringer Hintergrundfluoreszenz anwendbar.
Wenn Sie die Technik zum ersten Mal verwenden, stellen Sie sicher, dass die Di-Konzentrationen und Laserkräfte optimiert werden, um helle Einzelmolekülsignale zu beobachten. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, um zu sehen, wie die Di-Konzentration und Optimierung der Laserleistung zu hellen Einzelmolekülsignalen führt. Pflegen Sie die Säugetier-U2OS-Zellen in nicht fluoreszierenden DMBM mit 10% fetalem Rinderserum vier Millimolar-Glutamin, einem Millimolar-Natriumpyruvat und einem Prozent Penicillin-Streptomycin-Antibiotika in einem T-25-Kolben.
Teilen Sie die Zellen bei 70 bis 80% Konfluenz auf ein bis fünf, und Pipette in einem einzigen Brunnen einer acht Brunnenplatte. Ändern Sie die Zellen in der acht Brunnenplatte für 12 bis 24 Stunden. Zehn Minuten vor der Abbildung fügen Sie ein BODIPY-C12 Lysotracker Grün oder das andere BODIPY-Konjugat hinzu, fügen Sie eine endgültige Konzentration von 100 Nanomolar hinzu.
Montieren Sie die entsprechenden Filtersätze in den Emissionspfad, basierend auf der verwendeten Emissionsfarbe von BODIPY. Schalten Sie das Mikroskop ein. Mikroskopstufe, 488 Nanometer und 561-Nanometer-Laser, sowie die Kamera.
Fügen Sie einen Tropfen aufkommenden Öl auf dem Mikroskop Objektiv. Öffnen Sie die HAL4000-Software, die das LED-Licht für Lichtfeld-Bildgebung, Laserleistungen, Laserläden und Kameraeinstellungen für die Bildgebung steuert. Stellen Sie den EMVCD-Gewinn auf 30 und die Kameratemperatur auf minus 68 Grad Celsius.
Bereiten Sie die Kamera und die entsprechende Software vor, um Filme mit 20 Hertz aufzunehmen. Schalten Sie die Mikroskop-Bühnenheizung ein und stellen Sie sie auf eine Temperatur von 37 Grad Celsius und auf einen Kohlendioxidgehalt von fünf Prozent ein. Passen Sie die Objektivkorrekturfarbe entsprechend an.
Montieren Sie die Probe auf der Mikroskopstufe und fokussieren Sie, bis das Fokussiersystem eingreift. Verschieben Sie die Bühne mit dem Stufencontroller, bis fehlerbesagte Zellen im Sichtfeld angezeigt werden. Laden Sie Laser-Shutter-Sequenzen zur Anregung von Monumus sowie Dimmern, denen die Laserleistung des 561-Nanometer-Lasers auf bis zu 821 Kilowatt pro Quadratzentimeter für eine einzelne Molekül-Lokalisierungsmikroskopie liegt, so dass im rot verschobenen Emissionskanal einzelne Molekülfluoreszenzporen nachgewiesen werden.
Stellen Sie die Laserleistung zwischen Punkt 035 und Punkt 07 Watt pro Quadratzentimeter für den 488-Nanometer-Laser so ein, dass konventionelle Fluoreszenz im grünen Emissionskanal auftritt. Wählen Sie einen Zielordner für Filme aus, und zeichnen Sie 5000 bis 20000 Erfassungsframes auf, um genügend Lokalisierungen für die Rekonstruktion von Bildern mit super Auflösung zu sammeln. Wechseln Sie zu verschiedenen Sichtfeldern, und wiederholen Sie, um Daten für weitere Zellen zu sammeln.
Laden Sie den Film in eine Software für die Analyse der Analyse der Mikromikroskopie mit einem einzigen Molekül. Den Film visuell abschirmen und Kontrasteinstellungen anpassen, so dass ein fluoreszierendes Blinzeln einzelner Moleküle sichtbar ist. So legen Sie einzelne Molekül-Identifikationsparameter für die Anpassung des 2D Gaußian, PSFs, fest.
Zeigen Sie visuell durch einige Beispielrahmen, um die Identifikationsparameter zu überprüfen und die einzelnen Fluoreszenzausbrüche eines einzelnen Moleküls zuverlässig zu erkennen. Presseanalyse zur Durchführung der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie stellen Sie sich eine Analyse mit den optimierten Identifikationsparametern vor. Und dann, rendern Jedes einzelne Molekül als 2D Gaußian, dessen Breite durch die umgekehrte Quadratwurzel der entdeckten Anzahl von Photonen gewichtet wird.
Bewerten Sie die Qualität der Daten. Verwenden Sie eingeschränkte Rahmenbereiche, um einzelne Molekülverteilungen in spezifischeren Instanzen und zu bestimmten Zeiten zu beobachten. Dies ist für Organellenbewegungen während der Datenerfassung.
In dieser Studie haben wir ein optimiertes Probenvorbereitungs-, Datenerfassungs- und Analyseverfahren mit Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie mit BODIPY-Konjugaten vorgestellt. Um ein Beispiel für den Workflow zum Erfassen und Analysieren von Daten zur Lokalisierung von Einzelmolekülen zu veranschaulichen, wurde BODIPY in Hefe eingesetzt, um Lipidtröpfchen unterhalb der optischen Beugungsgrenze aufzulösen. Hier werden Beispiele für die verschiedenen multicolor Imaging-Modi von BODIPY in Konjugation mit anderen Sonden wie GFP und mEos2 gezeigt.
BODIPY-C12 bildete sich in mobilen nicht-lipid Tröpfchenclustern in der Zellperipherie beim Fasten, im Gegensatz zu ihrer Aufnahme in Lipidtröpfchen unter gefütterten Bedingungen. Um die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiefähigkeit von BODIPY-Konjugaten auf Säugetierzellen weiter auszubauen, wurden BODIPY-C12 und Lysotracker green in lebenden U2OS-Zellen abgebildet. Die Optimierung der BODIPY-Konzentration sowie die Erregender der Laserkräfte sind entscheidende Schritte, um helle Einzelmolekülsignale zu visualisieren und Bilder mit super Auflösung zu rekonstruieren.
Diese Methode kann mit jedem anderen BODIPY-Konjugat verwendet werden, um hochauflösende Einblicke in die spezielle zeitliche Verteilung bestimmter Biomoleküle in lebenden Zellen zu gewinnen. Unsere Technik ebnete den Weg, um die Lipidtröpfchen- und Fettsäurebiologie auf der nanoskopischen Linsenskala weiter zu befragen. Diese Anwendung geht jedoch weit über die spezifischen philopectetes aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen funktionellen BODIPY Konjugaten.
Bitte beachten Sie die Standard-Betriebsverfahren für den Umgang mit den biologischen Proben und Farbstoffen, und seien Sie auch unsere verpflichteten Hedger und folgen Sie den Lasersicherheitsverfahren.
