Die Herstellung von fluoreszierenden Antibiotika ermöglicht die Beurteilung der Lokalisierung dieser therapeutischen Reagenzien in Bakterien durch praktische Analysetechniken wie Spektrophotometrie und Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Leichtigkeit, mit der die Antibiotikalokalisierung bestimmt werden kann. Diese Lokalisierung ist für eine Reihe von Phänomenen einschließlich Efflux relevant.
Um das Klicken ein Reaktionsverfahren durchzuführen, legen Sie das Azid-Antibiotikum von Interesse in einen runden Bodenkolben und fügen Sie 25 Milliliter Tert-Butanol und 25 Milliliter Wasser pro Millimol Von Azid in den Kolben. Fügen Sie das vorbereitete Fluorophoralkyn in die Lösung und erhitzen Sie die Reaktion auf 50 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 0,6 Äquivalente Kupfersulfat und 2,4 Äquivalente Ascorbinsäure in den Kolben.
Rühren Sie die Reaktion für eine Stunde oder bis die Analyse durch LCMS auf die Abschlusszeit der Reaktion hinweist. Dann kühlen und reinigen Sie die Reaktion entsprechend für das Antibiotikum Gerüst. Hier werden die wichtigsten Tastenklick-Chemiereaktionen für die Herstellung von fluoreszierenden Antibiotika mit Beispielen der Struktur gezeigt, die aus den entsprechenden Antibiotika über ein Azid-Zwischenprodukt auf Basis von Ciprofloxacin, Linezolid und Trimethoprim synthetisiert werden.
In diesen flüssigen Chromatographie-Massenspektrometriespuren von einem Ciprofloxacin-Azid und einer NBD-Alkyn-Klick-Reaktion wurde das Azid nach 3,2 Minuten eluiert und das Produkt nach 3,8 Minuten eluiert. Auf den Fortschritt der Klickreaktion kann das Verschwinden des Azidgipfels folgen. In diesen Spektren kann der Einfluss der Reinigung visualisiert werden, wenn fehlerhafte Spitzen verschwinden.
Um die antimikrobielle Aktivität des synthetisierten Antibiotikums zu bewerten, streifen Sie Glyzerinbestände von Bakterienstämmen, die für das Antibiotikumgerüst auf LB-Agarplatten geeignet sind, und wachsen die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus jedem Teller und Kultur die Kolonien über Nacht in fünf Milliliter CAMHB pro Kultur bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag verdünnen Sie die Kulturen etwa 40-fach in frischem CAMHB und wachsen die Bakterien bis zur mittleren Logphase mit einer optischen Dichte von 600 Nanometern zwischen 0,4 und 0,8.
Als nächstes bereiten Sie Lagerlösungen für jedes fluoreszierende Antibiotikum mit 1,28 Milligramm pro Milliliter in 20% Dimethylsulfoxid in sterilem Wasser vor und fügen 10 Mikroliter Antibiotikum in jeden Brunnen der ersten Säule einer 96-Well-Platte hinzu. Fügen Sie 90 Mikroliter CAMHB zu jedem Brunnen der ersten Säule und 50 Mikroliter zu allen anderen Brunnen hinzu. Führen Sie dann eine serielle zweifache Verdünnung über die Platte aus.
Nach gründlicher Vermischung die Mid-Log-Phasenkulturen auf etwa ein mal 10 bis die sechste Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter verdünnen und 50 Mikroliter jeder Kultur in die Verdünnungsbrunnen geben, um eine Endkonzentration von etwa fünfmal 10 zu den fünften Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu erhalten. Wenn alle Bakterien plattiert sind, legen Sie Deckel auf die Teller und bebrüten die Kulturen für 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius ohne zu schütteln. Am nächsten Tag die Platten visuell inspizieren.
Die minimale Hemmungskonzentration wird die niedrigste Konzentration gut ohne sichtbares Wachstum sein. Für die Sondenakkumulationsanalyse werden die Glyzerinbestände der Bakterienstämme auf LB-Agarplatten für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius aufgebracht. Am nächsten Morgen, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte für die Nachtkultur in Lysogeny Brühe bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Nachtkultur etwa 50-fach in frischem Medium. Wenn die Kultur die mittlere Log-Phase erreicht, pellet die Bakterien durch Zentrifugation und dekantiert das Medium. Setzen Sie die Bakterien in einem Milliliter PBS aus und zentrifugieren Sie die Bakterien wieder.
Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie das gewaschene Pellet in PBS auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von zwei zurück. Fügen Sie 10,1 Mikroliter 10 Millimolar CCCP in PBS zu einem Milliliter Bakterien hinzu und bebrüten die Bakterien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation die Bakterien durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter von 10 bis 100 mikromolaren fluoreszierenden Antibiotikalösung in PBS wieder aufsetzen.
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius die Zellen viermal in einem Milliliter kalten PBS pro Waschgang durch Zentrifugation waschen. Nach dem Waschen lysieren Sie die Bakterien mit 180 Mikroliter Lysepuffer und 70 Mikroliter Lysozym. Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius die Bakterien dreimal bei minus 78 Grad Celsius für fünf Bzw. 34 Grad Celsius für 15 Minuten einfrieren.
Nach der letzten Runde des Gefrierens, beschallen Sie die Probe für 20 Minuten, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 65 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die lysierte Probe durch Zentrifugation sammeln und den Rohrinhalt durch eine 10 Kilodalton-Filtermembran belasten. Waschen Sie den Filter viermal mit 100 Mikroliter Wasser pro Waschgang und aliquot jeder waschen in einzelne Brunnen einer schwarzen flachen Boden 96-Well-Platte.
Messen Sie dann die Fluoreszenzintensität eines Plattenlesers mit Anregungs- und Emissionswellenlängen, die dem Fluorophor entsprechen. Diese typischen Ergebnisse aus der Bewertung der intrazellulären Akkumulation durch Fluoreszenzspektroskopie in Gegenwart und Abwesenheit von Efflux zeigen, dass die intrazelluläre Fluoreszenz der Bakterien nach der Vorbehandlung mit CCCP signifikant höher ist, was darauf hindeutet, dass Efflux die Akkumulation innerhalb der Bakterien reduziert. In diesen repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien kann die Lokalisation des Antibiotikums innerhalb der Bakterien nach der CCCP-Behandlung visualisiert werden.
Dieses Phänomen wird nicht beobachtet, wenn keine CCCP hinzugefügt wird. Achten Sie bei der Verwendung von fluoreszierenden Antibiotika darauf, welche Informationen Sie sammeln möchten, und achten Sie darauf, dass das Protokoll am nützlichsten ist, wenn Sie diese Daten erhalten. Nach ihrer Synthese können fluoreszierende Antibiotika verwendet werden, um eine Reihe von bakteriellen Prozessen zu untersuchen, einschließlich Wechselwirkungen mit Wirkstoffzielen und Resistenzmodifikationen.
