Single Cell Micro-Aspiration ist eine Methode zur Ergänzung der verschiedenen Techniken, die im Bereich der Mikrobiologie im Allgemeinen und in der Virologie im Besonderen eingesetzt werden. Es könnte Schlüsselfragen beantworten und Probleme lösen, die während der Isolierung von Riesenviren auftreten, indem es ein Virus von einer Virusmischung trennt, die eine geringe Überflussmenge virus, wie es der Fall für Umsatzviren, Clandisinal-Virus und Uzibati-Virus von einem anderen war, das Faustovirus, in großer Fülle sowieso vorhanden war. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Verwendung einer indirekten Strategie.
Es besteht aus der Trennung und dem Klonen des infizierten Hosts, um eine virale Trennung zu erhalten. Diese Methode überwacht also die verschiedenen Schritte von der Erfassung bis zur Freisetzung von Zellen und bestätigt den Sortierprozess durch mikroskopische Beobachtung. Schließlich wird die Molekularbiologie verwendet, um die Sortierung und elektronische Mikroskopie zu bestätigen, um die getrennten Viruspartikel zu beobachten.
Dieser Ansatz wird das Hauptproblem der Virustrennung lösen. Es ist eine Prospektin für das Klonen von Ameba oder Klonprotisten im Allgemeinen. Die Person, die versucht, diese Technik zum ersten Mal zu verwenden, muss bei der Druckkontrolle rigoros und präzise sein.
Die visuelle Kontrolle ist wichtig, um die Erfassung und Freisetzung von nur einer Zelle zu bestätigen. Verwenden Sie Vermamoeba Vermiformis, Sorte CDC 19, als Zellunterstützung. Fügen Sie 30 Milliliter PYG Medium und drei Milliliter der Amöbe in einer Konzentration von ein mal zehn zu den sechsten Zellen pro Milliliter in einem 75 Quadratzentimeter Zellkulturkolben hinzu.
Bewahren Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius in einem Inkubator. Nach 48 Stunden 10 Milliliter der Amöbenzellkultur auf eine Zählrutsche übertragen und unter ein Mikroskop stellen, um die Amöbe zu quantifizieren. Zum Spülen 30 Milliliter der Zellkultur in einem Rohr ernten und die Amöbe durch Zentrifugation bei 720 mal G 10 Minuten pellet.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Hungermediums wieder auf, um die Konzentration von einem mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter zu erhalten. Bereiten Sie die zelluläre Unterstützung mit der Zugabe von antimikrobiellen Mitteln vor. In einem Biosicherheitsschrank ein mal 10 zu dem sechsten amöben Kultur in zwei Milliliter Hungermedium hinzufügen.
Dann impfen 100 Milliliter der Stammlösung, die die Mischung von Viren in die Amöbenzellkultur unterstützen bei einer Vielzahl von Infektionen von 0,01. Inkubieren Sie die infizierte Amöbenzellkultur Unterstützung. Fügen Sie 30 Grad Celsius für 10 bis 14 Stunden hinzu oder bis zytopathische Effekte wie Amöbenrundung oder Lyse induziert werden.
Als nächstes verwenden Sie eine Spritze, um die Medien zu sammeln und filtrat durch einen Fünf-Mikron-Filter, um Zellabfall zu entfernen. Führen Sie eine Getreideverdünnung der Virusprobe im Hungermedium in verschiedenen Brunnen durch. Impfen Sie zwei Milliliter von einem mal 10 bis zum sechsten Vermamoba Vermaformis, die in jeder Petrischale mit 100 Millilitern der Mischung Inoculum enthalten sind.
Dann legen Sie die Petri-Gerichte in eine verschließbare Plastiktüte bei 30 Grad Celsius. Nach der Infektion sechs Stunden nach der Infektion die Petrischalen mit invertierter optischer Mikroskopie beobachten und alle vier bis acht Stunden die Zellmorphologie überprüfen. Die antimikrobielle Behandlung ist für die zelluläre Unterstützung.
Wählen Sie unter den Petri-Schalen die, die keine visuelle Kontamination durch Pilz- und Bakterienmittel und mit Nachweis der zytopathischen Wirkung von Amöben aufgrund der Viren und mit Prälyse und Rundungsphase der Amöben, um das Streben von viralen Partikeln zu vermeiden. Richten Sie einen Arbeitsplatz mit Mikromanipulator, manuellem Steuerdruckgerät, invertiertem Mikroskop, Plug & Play Motormodulen, Kamera und Computermodul ein. Wählen Sie eine Mikrokapillare von 20 Mikron Innendurchmesser, um die Abergung einer inneren Position und eine einfache Freisetzung der Zelle zu ermöglichen.
Fixieren Sie den Betriebswinkel des Greifsystems am motorisierten Modul auf 45 Grad. Führen Sie eine Doppelinstallation durch, zuerst auf dem Greifsystem und dann auf der Mikrokapillare. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen.
Um Zellen zu klonen, legen Sie die Petrischale mit zwei Millilitern infizierter Amöben unter das Mikroskop. Konzentrieren Sie sich zuerst auf die Zellen und dann auf die Mikrokapillare, die in die Kultur eingetaucht ist. Kommissionieren Sie abgerundete Einzelzellen und bringen Sie die Mikrokapillare näher an den Mikromanipulator.
Üben Sie weiche Aspiration mit manueller Druckkontrolle auf die Zelle, die sie innerhalb der Mikrokapillare nimmt Entfernen Sie die Einzelzelle aus der ersten Probe und lassen Sie sie in der Zellkulturunterstützung der Amöben frei. Dann bebrüten Sie es bei 30 Grad Celsius. Kontrollieren Sie sorgfältig den Druck, um eine einzelne Zelle anstreben zu können, und steuern Sie Ihre Aspiration durch die Beobachtung der Freisetzung einer einzelnen Zelle.
Führen Sie tägliche Beobachtungen mit einem invertierten optischen Mikroskop durch, um das Aussehen der Zellen zu beobachten und die Entstehung des zytopathischen Effekts zu überwachen. Betreiben Sie nun ein automatisiertes Extraktionssystem, um DNA aus einem Teil der positiven Kulturproben zu extrahieren, in dem eine zytopathische Wirkung beobachtet wird. Entwerfen Sie Primer, um schlechte Gene zu verstärken, die als RBP2 für das Faustovirus, das Hauptcapsidprotein für das Usurpatvirus und das kleinere Capsid-Protein für das Clandestinovirus bezeichnet werden.
Führen Sie Standard-PCR mit einem Thermocycler gemäß dem Manuskript. Führen Sie 20 Mikroliliter von PCR-Reaktionen mit 50 Mikromolaren pro Primer, 1X Master Mix und Ribonuklease-freiem Wasser durch. Führen Sie die PCR-Produkte mit DNA-Gel-Färbung auf einem 1,5%Agarose-Gel bei einer Spannung von 135 Volt und visualisieren Sie mit UV. Dieses Protokoll optimiert einen Mikromanipulationsprozess mit einzelligem Mikroanspruch.
Diese Technik ermöglicht die Erfassung einer abgerundeten und infizierten Amöbe und deren Freisetzung in einer neuartigen Platte, die nicht infizierte Amöben enthält. Dieser Ansatz isolierte erfolgreich einen neuen Riesenvirus mit geringer Häufigkeit namens Userpatvirus LCD7. Ihr Userpatvirus wurde nur in Klon sieben mit Anwesenheit von Userpatvirus LCD7 DNA und Abwesenheit von Faustovirus DNA beobachtet.
Die Elektronenmikroskopie zeigte das Auftreten des Clandestinovirus ST1, das eine typische ikosaedrale Morphologie ohne Fibrillen sowie das Usurpatvirus LCD7 mit einem Icosahedral-Capsid von etwa 250 Nanometern hat. Niedrige Zytometrie bestätigt die Überlappung der Populationen von Faustovirus und Nauvoirus. Einmal gemeistert, kann diese Prozedur leicht durchgeführt werden.
Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollte, ist die Notwendigkeit eines Minimalbeobachtungsrituals über die Größe der Einheiten mit der guten Handhabung des zuständigen Arbeitsplatzes und der Kontrolle von Kontaminationsproblemen. Dieser Ansatz kann als Sortiertechnik auf der Grundlage der Zellmorphologie verwendet werden. Derzeit wird es in unserem Labor zum Klonen bestimmter Amöben eingesetzt.
Ein kritischer Punkt dieser Technik ist die Aufrechterhaltung der Zellintegrität. In der Tat können wir einige Probleme mit der Nichtbeobachtung der Zelle oder Freisetzung haben. Dies ist vor allem auf den Zerfall der Zelle in die Mikrokapillare zurückzuführen.
Diese Methode könnte eine effiziente Alternative sein, wenn Fehlertelemetrie und Faktensortierung nicht verfügbar sind und bestimmte technische Einschränkungen erreicht werden. Vergessen Sie nicht, dass die Zelle in einigen Fällen nicht aus der Mikrokapillare freigesetzt wird. Dies ist zum Teil auf die Amöben-Eigenschaften und ihre Anpassungsfähigkeit und dann von der Zellmembran zurückzuführen.
