Das zentrale Ziel für die Entwicklung der csBN-MS-Technik war der umfassende Zugang zur Organisation und Montage von Proteinkomplexen, die der Signaltransduktion an und über die Plasmamembran verschiedener Gewebe- und Organtypen zugrunde liegen. csBN-MS bietet derzeit die höchste Auflösungsvielfalt für die Analyse des nativen Proteinkomplexes und deren Zusammensetzung, insbesondere in Bezug auf Membranproteine. Obwohl die csBN-MS-Technik entwickelt wurde, um komplexe Mischungen von Membranprotein-Baugruppen im Nagetierhirn zu analysieren, kann sie leicht an die Analyse jeder Art von biologischer Probe angepasst werden.
Einer der wichtigsten Schritte unserer Methode ist die Einbettung des Gelstücks und seine korrekte Ausrichtung auf die Schnittebene vor dem Schneiden. Achten Sie darauf, das Gel nicht zu zerreißen oder zu komprimieren und sicher zu sein, dass es nicht auf die Schnittebene geneigt ist, da dies die Auflösung der Analyse reduzieren würde. Unsere csBN-MS-Technik verfügt über mehrere praktische Schritte, die für gute Ergebnisse entscheidend sind.
Es ist einfacher zu zeigen, wie diese Schritte im Detail ausgeführt werden, als sie einfach zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen rührenden Zweikammer-Gradientenmischer, der von einer Pumpe angetrieben wird, um ein lineares oder ein hyperbolisches Porengradientengel zu gießen. Bereiten Sie Lösungen für die vordere Mischkammer und Reservoirkammer vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Starten Sie den Rührer und fügen Sie 30 Mikroliter APS und 2,5 Mikroliter TEMED in die Lösung in der vorderen Kammer hinzu. Starten Sie dann die Pumpe und öffnen Sie das Vorderventil. Nach etwa einer Minute 90 Mikroliter APS und fünf Mikroliter TEMED in die Reservoirkammer geben und den Kammeranschluss öffnen.
Lassen Sie das Gel mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam und gründlich polymerisieren, um einen homogenen Porengrößengradienten zu erzeugen. Bei Feuchtgehalten kann das polymerisierte Gel bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius aufrecht gelagert werden. Als nächstes bereiten Sie die Ladeschlitze vor, indem Sie die entsprechenden Leerzeichen zwischen den Glasplatten einlegen, um zwischen 0,5 und 2,0 Milligramm Protein zu trennen.
Die Schlitze sollten mindestens drei Zentimeter breit sein. Für laufende Puffer einen stehenden Kathodenpuffer vorbereiten, der aus 50 Millimolar-Tricin, 50 Millimolar-Bis-Tris und 0,01%Coomassie G-250 besteht. Bereiten Sie einen Standard-Anodenpuffer vor, der aus 50 Millimolaren Bis-Tris besteht.
Solubilisieren Sie ca. 2,5 Milligramm Membran und zwei Milliliter Löslichkeitspuffer, der 1%nicht-denaturierendes Reinigungsmittel auf Eis für 30 Minuten enthält. Dann Ultrazentrifugieren bei 130. 000 mal G für 11 Minuten. Konzentrieren Sie das Solubilisate auf einen kurzen 50%20%Sucrose-Schrittgradienten durch Ultrazentrifugation bei 400. 000 mal G für eine Stunde.
Danach ernten Sie den Saccharosegradienten von der Unterseite des Rohres, fügen Sie 0,05%Coomassie G-250 zum Solubilisate hinzu und laden Sie die Probe auf das Gel. Führen Sie einen präparativen BN-PAGE bei 10 Grad Celsius über Nacht mit einem dreistufigen Spannungsprotokoll aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem das Gel ausgeführt wurde, scannen Sie die Gele zu Dokumentationszwecken und halten Sie es zwischen den Glasplatten.
Prüfen Sie die Qualität der Geltrennung. Als nächstes, dissemble die Platten und Verbrauch die Spur Abschnitte von Interesse. Fixieren Sie die Bahnen zweimal mit 30% Ethanol und 15% Essigsäure für mindestens 30 Minuten.
Übertragen Sie die Probe des Einbettmediums und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden einweichen und aushalten, während die Gelplatte in Zeitlupe auf einem Orbital-Shaker gehalten wird. Schneiden Sie dann die festen Gelspuren in Abschnitte genau parallel zur Proteinmigrationsfront oder dem Bandmuster. Platzieren Sie jeden Abschnitt auf einer Kunststofffolienstütze mit gleichen Abmessungen für eine einfachere Handhabung.
Übertragen Sie die Fahrspuren in ein offenes Rohr mit Stopfen, die unten geschlossen und oben zentral perforiert sind, beide präzise am oberen und unteren Ende des Gelabschnitts ausgerichtet. Tauchen Sie den Zylinder kurz in den flüssigen Stickstoff, um die Erstarrung schnell einzuleiten. Das transparente Einbettmedium verfestigt sich innerhalb von Sekunden und wird weiß in der Farbe.
Füllen Sie den Hohlraum mit einbettendem Medium, tauchen Sie den Zylinder kurz in flüssigen Stickstoff und lassen Sie ihn dann bei minus 20 Grad Celsius mehrere Stunden gründlich einfrieren. Nach der Demontage die Kunststofffolie entfernen und den Block mit dem eingebetteten Gelabschnitt in einen gekühlten Metallzylinder übertragen. Der Zylinder ist größer im Durchmesser und außen mit Einbettmedium abgedichtet.
Es wird auf einem flachen Träger platziert. Füllen Sie den Zylinder mit einbettendem Medium und frieren Sie gründlich ein, wie bereits erwähnt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der anderen Seite des Zylinders, um einen festen Block mit einer koplanaren Bodenfläche zu erhalten.
Entfernen Sie dann den Block aus dem Zylinder und verwenden Sie ein einbettendes Medium, um ihn an einen vorgekühlten Metallhalter zu kleben. Stecken Sie den Metallhalter in die Kryomaschine. Der Halter muss sorgfältig auf die Schnittebene ausgerichtet werden.
Lassen Sie den Block auf die optimale Temperatur für den Schneidprozess ausdemivieren. Nach dieser Ernte schneidet das Gel nacheinander mit einer endgültigen gewünschten Dicke von 0,25 Millimetern Schrittgröße und überträgt sie einzeln in Reaktionsröhrchen mit geringen Proteinbindungseigenschaften. Anschließend werden die Scheiben einer tryptischen Verdauung und massenspektrometrischen Analyse unterzogen.
Dieses Protokoll erweitert die Anwendung von hochauflösendem Complexome-Profiling auf nicht-mitochondriale Membranen, die wenig reichliche Proteine exdrücken. Komplexe Trennung zeigt stark gefärbte Proteinbänder mit sehr wenig Migrationsartefakten. Abweichungen von Peptidsignalen in Masse und Retentionszeit deuten auf eine sehr niedrige Rate bei falsch positiver Spitzenvolumenzuweisung hin.
Run-to-Run-Variationen werden durch neu skalieren der Spitzenvolumen-Datensätze leicht eliminiert. Die resultierenden Peptidintensitätsinformationen werden dann verwendet, um 2545 Proteinprofile relativer Häufigkeit zu rekonstruieren. Die Relevanz der Größe der Gel-Probenahme-Schrittgröße für die Auflösung von Proteinkomplexen wurde durch Das Verbinden von Datensätzen benachbarter Slices bewertet.
Mit 0,25 Millimetern stimmt die Größentrennung der TPC1-assoziierten komplexen Populationen gut mit den Ergebnissen der Western Blot-Analyse überein. Durch die Verbindung von mehr als zwei Scheiben wird die Diskriminierung komplexer TPC1-Teilpopulationen abgeschafft. Schließlich liefert die Analyse Informationen über gut charakterisierte Komplexe und zeigt die Existenz neuartiger Untereinheiten und komplexer Baugruppen.
Für Ferritin deuten die um ihre relative Häufigkeit bereinigten Untereinheitsprofile auf die Existenz von mindestens drei komplexen Isoformen mit ausgeprägten schweren/leichten Kettenstoichiometrien hin. Nicalin-Nomo1-Komplexe, der Gamma-Sekretase-Kernkomplex und die GPI-Transamidase-Maschinen weisen dagegen feste Häufigkeitsverhältnisse ihrer Kernuntereinheiten über den gesamten Größenbereich auf und sind unabhängig von der Assoziation mit zusätzlichen Proteinen. Der Schlüsselparameter der csBN-MS-Analyse ist die effektive Auflösung von Komplexen, die durch Probenbiochemie, BN-Gelqualität, richtige Ausrichtung beim Einbetten und Schneiden und Qualität der erfassten MS-Daten bestimmt wird.
Das Kombinieren von csBN-MS mit der Isotopenkennzeichnung von Proteinen und Proben ermöglicht einen direkten Vergleich von Komplexstoffen in verschiedenen pathophysiologischen, biologischen oder Entwicklungszuständen. csBN-MS, das an Membranen des Nagetierhirns durchgeführt wurde, zeigte die enorme Vielfalt von Rezeptoren, Ionenkanälen und Transportern in Bezug auf ihre Zusammensetzung der Untereinheit und ihre Funktion, und es wird für die Analyse der 3D-Struktur in nativen Präparaten von entscheidender Bedeutung sein.
