Die Lattice-Lichtbogenmikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnologie, aber nur wenige Labore auf der Welt sind in der Lage, sie zu verwenden. Dieses Protokoll gibt einen detaillierten Überblick über den Einsatz des handelsüblichen Gitter-Lichtbogenmikroskops. Es ist ein extrem leistungsfähiges System, das in der Lage ist, einzelne Zellen oder Embryonen vierdimensional zu bebildern, was eine Echtzeitverfolgung von Molekülen ermöglicht.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einzelne lebende Zellen oder Organe mit hoher raumzeitlicher Auflösung und minimaler Fotobleiche dreidimensional abbilden kann. Das Gittermuster des Lichtbogens ermöglicht es uns, Hochgeschwindigkeits-Bildproben zu erstellen und Echtzeitvideos von dreidimensionalen lebenden Zellen und Organen mit molekularen Details zu erhalten, die andere Techniken nicht erreichen können. Dieses erste Videoprotokoll zeigt, wie wir Lichtbogenmikroskopie vergittern, um einzelne Zellen vierdimensional abzubilden.
Dies ist eine sehr komplizierte Technik aufgrund der Ausrichtung und Probenvorbereitung. Und wir glauben, dass visuelle Demonstration die Zugänglichkeit verbessern wird, indem es mehr Wissenschaftlern ermöglicht wird, viele verschiedene Moleküle, Zellen und Organe in der Biologie abzubilden. Um dieses Verfahren zu beginnen, inkubieren Sie fünf Millimeter runde Abdeckungen mit 0,1%Poly-L-Lysin bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Die Flüssigkeit absaugen und die Deckellipsen auf natürliche Weise trocknen lassen. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter Dichtegradient zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu. Fügen Sie vorsichtig Zellen tropfenweise an den Rand des Rohres.
Zentrifuge bei 930 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie anschließend sorgfältig die dünne mittlere Zellschicht zwischen dem gesamten Medium und dem Dichtegradientenreagenz, um sicherzustellen, dass jeder Zelltyp in ein separates konisches Rohr gelegt wird. Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten, um die Zellen zu waschen.
Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter RPMI zu den Röhren von T-Zellen und CH27-Zellen hinzu. Wiederholen Sie die Wäsche mit frischem RPMI, bis drei Gesamtwäschen durchgeführt wurden. Setzen Sie dann die Zellen in jeder Röhre mit einem Milliliter vollständiger RPMI wieder aus und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Setzen Sie eine Million antigenpräsentierende Zellen in 500 Mikrolitern kompletten RPMI aus und fügen Sie 10 mikromolare SMCC hinzu. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei Stunden inkubieren. Danach setzen Sie eine Million T-Zellen in 500 Mikroliter n. Chr.
Fügen Sie zwei Mikrogramm Anti-TCR Beta Alexa 488 mit der Bezeichnung FAB hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Als nächstes zentrieren Sie beide Zellen bei 300 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter komplettes RPMI hinzu und wiederholen Sie die Zentrifuge, um die Zellen zu waschen.
Wiederholen Sie die Wäsche mit frischem RPMI, bis drei Gesamtwäschen durchgeführt wurden, die den Überstand nach jeder Wäsche entsorgen. Danach setzen Sie beide Zelltypen in 500 Mikroliterbild wieder aus. Fügen Sie zunächst 10 Milliliter Wasser und 30 Mikroliter Fluorescein in das LLSM-Bad.
Drücken Sie Bild nach Hause, um das Objekt in die Bildposition zu verschieben und ein einzelnes Bessel-Laserstrahlmuster zu betrachten. Richten Sie den Laserstrahl mit der Führung und dem voreingestellten Bereich von Interesse aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster zu machen, das in alle Richtungen ausbalanciert ist. Der Strahl sollte auch in der Finderkamera fokussiert erscheinen.
Verwenden Sie die beiden Spiegelneigungsregler, das Mikrometer mit dem oberen Fokus und die Objektivfarbe, um den Strahl anzupassen. Als nächstes waschen Sie das Bad und die Ziele mit mindestens 200 Milliliter Wasser, um fluorescein vollständig zu entfernen. Um Standard-Leuchtstoffperlen abzubilden, schalten Sie Dither ein, indem Sie in der Xgalvo-Bereichsbox auf drei setzen und Live drücken, um das aktuelle Feld anzuzeigen.
Passen Sie den Neigungsspiegel, die Objektivfarbe und das Fokusmikrometer manuell für höchste Grauwerte an. Passen Sie dann bei Bedarf an, um die richtigen Muster für den Objektivscan, Z galvo, Z plus Objektiv und die Stichprobenaufnahmemodi zu erhalten. Danach drücken Sie Execute im Sample-Scan-Modus, um die Sample-Point-Spread-Funktion für De-Skewing und De-Convolution zu sammeln.
Ändern Sie die Laser in den Dreifarbenmodus, und drücken Sie erneut Ausführen. Fügen Sie zunächst 100.000 antipräsentierende Zellen zu dem vorbereiteten kreisförmigen Abdeckungsrutsch mit fünf Millimeterdurchmessern hinzu und lassen Sie sie sich für 10 Minuten begnügen. Fetten Sie den Probenhalter und fügen Sie den Coverslip zur Zellseite hinzu.
Fügen Sie als Nächstes einen Tropfen Bildverarbeitungsmedien auf der Rückseite des Coversliphinzus hinzu. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo und drücken Sie Image Home. Finden Sie eine Antigen-präsentierende Zelle zum Abbild und stellen Sie sicher, dass die LLSM- und Bildverarbeitungssoftware ordnungsgemäß funktioniert.
Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um den Deckzettel und die Zellen zu finden. Finden Sie das Zentrum einer Antigen-präsentierenden Zelle, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten.
Überprüfen Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein. Drücken Sie center, und drücken Sie dann Execute, um die Daten zu sammeln. Senken Sie die Stufe auf die Lastposition und fügen Sie 50 Mikroliter T-Zellen und Bildmedien tropfenweise direkt über den Deckelschlupf hinzu.
Am besten lassen Sie einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze bilden und berühren Sie dann die Spitze an der Badeflüssigkeit. Heben Sie die Bühne zurück, indem Sie auf Bildrückgabe klicken. Beginnen Sie mit der Bildgebung.
Stellen Sie sicher, dass Sie den gewünschten Z-Stack und die Länge des Zeitraffers einstellen. Bild 60 Z stapelt beispielsweise mit einer Schrittgröße von 0,4 Mikrometern und gibt 500 Zeitrahmen ein. Beenden Sie die Aufnahme, bevor 500 Frames erreicht werden, um Fotobleichen zu vermeiden.
Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn bereite und gewünschte Einstellungen eingegeben wurden, drücken Sie Ausführen, um Daten zu sammeln. In dieser Studie werden primäre Maus 5CC7 T-Zellen isoliert und vorbereitet und dann mit einem Gitter-Lichtbogenmikroskop abgebildet. Hier werden die richtigen Strahlweg und Strahlausrichtung gezeigt, wenn sie mit Fluorescein abgebildet werden.
Der Objektivscan sollte in den XZ- und YZ-Projektionen eine große X-Form aufweisen, die so symmetrisch wie möglich ist. Sie sollten auch so angepasst werden, dass sie so klein wie möglich von einem X sind. Der Z-Galvo-Scan sollte ein Oval in XZ und XY mit einem einzigen Punkt auf beiden Seiten anzeigen.
Schließlich sollten sowohl der Z plus Objektivscan als auch der Beispielscan Punkte anzeigen, die so rund wie möglich aussehen. Anhand dieses Protokolls konnte die vierdimensionale Dynamik der T-Zell-Rezeptoren auf einer T-Zell-Oberfläche gesehen werden. Der Hauptvorteil dieses Mikroskops liegt in der Fähigkeit, die visualisierten Oberflächeneinheiten der T-Zell-Rezeptoren zu verfolgen und quantifizierte Daten aus größe, Bewegung, Signalintensität und Ausscheidung zu erhalten.
Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist die Qualität Ihrer Ausrichtung. Das Gitterlichtblatt muss täglich ausgerichtet werden, und wenn dies nicht richtig geschieht, führt dies zu einer verzerrten Bildgebung. In ähnlicher Weise wirkt sich die Qualität der gesammelten PSF direkt auf die Qualität der Devolution aus, was letztendlich zur Qualität Ihres endgültigen Bildes führt.
Einer der Gründe, warum diese Methode so leistungsstark ist, ist, dass jede Zelle und jedes Etikett ersetzt werden kann, um viele Zelltypen und Moleküle zu visualisieren. Daher kann diese Methode verwendet werden, um alle Fragen im Zusammenhang mit der vierdimensionalen Nachverfolgung von Molekülen zu beantworten. Wir glauben, dass diese Technik den Weg für Forscher ebnen wird, neue Fragen im Bereich des Molekularhandels zu erforschen.
Es ist noch nicht weit verbreitet aufgrund des komplizierten Systems, so dass wir hoffen, dass dieses Jove Video die Zugänglichkeit auf die Technik verbessern wird. Die laser, die auf dem System verwendet werden, sind Klasse vier, daher ist absolute Vorsicht geboten, um die Lasersicherheit zu gewährleisten. Bitte nehmen Sie vor der Anwendung dieser Methode an einem erforderlichen Lasersicherheitstraining teil.
