Lipoproteinpartikel sind native Transportfahrzeuge. Die Anreicherung von Fremdstoffen erleichtert deren Verwendung als Gleisträger. Die spezifische Kennzeichnung von Molekülen oder ganzen Partikeln macht es möglich, die zelluläre Aufnahme zu messen.
Die beiden Anreicherungsmethoden sind schnell und einfach zu bedienen und können für eine Vielzahl von Stoffen angepasst werden. Demonstriert wird das Verfahren von Markus Axmann und Andreas Karner, zwei Postdocs aus meinem Labor. Um mit der Delipidation in einer Dunstabzugshaube zu beginnen, mischen Sie ein bis zwei Milliliter vorbereitete HDL-Lösung mit fünf Milligramm HDL-Partikeln mit 50 Millilitern vorgekühlter Drei-zu-zwei-Mischung aus Ethanoldiethylether in einem konischen Zentrifugationsrohr.
Zwei Stunden bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge bei 2500 mal g für 10 Minuten bei negativen 10 Grad Celsius. Den Überstand entsorgen, das Pellet in 50 Milliliter vorgekühltem Ethanol-Diethyl-Ether-Gemisch wieder aufhängen und kurz wirbeln.
Ein zweites Mal für zwei Stunden bei negativen 20 Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge wieder bei 2500 mal g für 10 Minuten bei negativen 10 Grad Celsius. Legen Sie dann Schläuche ein, die Stickstoffgasstrom liefern, um das Pellet zu trocknen.
Und setzen Sie es in 250 Mikroliter Puffer A. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford Protein-Assay oder einem anderen geeigneten. Es ist wichtig, Reste des Ethanol-Diethylether-Gemischs zu entfernen, da diese Lösungsmittel die Relipidation von Apolipoproteinen hemmen würden. Als nächstes auf eine Endkonzentration von einem Milligramm Protein pro 250 Mikroliter Puffer A. Verdünnen Sie einen Schlauch, der Inertgas liefert, in den Lösungsteil in der Röhre.
Lagern Sie die Lösung bei Bedarf über Nacht bei vier Grad Celsius unter der Inertgasatmosphäre. Um mit der Rekonstitution zu beginnen, in einem sauberen Glasrohr, mischen 100 Mikroliter CO, 13,5 Mikroliter C, und 500 Mikroliter PC. Drehen Sie dann das Glasrohr, während Stickstoffgas in das Rohr gespült wird, um das Gemisch zu trocknen, um eine homogene Oberflächenschicht zu ergeben. In einem 0,5-Milliliter-Reaktionsröhre eine frische 30-Millimolar-Sperminlösung im Puffer A vorbereiten. Mischen Sie dann 100 Mikroliter 10-Mikromolar synthetische microRNA mit 100 Mikroliter Sperminlösung in einem Zwei-Milliliter-Reaktionsröhre.
Und für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius brüten. Als nächstes übertragen Sie die inkubierte 200-Mikroliter-Lösung in das Glasrohr, um die vorbereitete PC-CO-C-Mastermix-Oberflächenschicht zu rehydrieren. Und dann fügen Sie 50 Mikroliter einer 30 Milligramm pro Milliliter Natriumdeoxycholat-Lösung.
Zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius umrühren. Danach 250 Mikroliter der delipidierten HDL-Lösung in das Glasrohr geben. Und bei vier Grad Celsius über Nacht rühren.
Um mit der Dialyse zu beginnen, fügen Sie zunächst 50 Gramm adsorbierende Perlen zu 800 Milliliter doppelt destilliertem Wasser hinzu. Und verwenden Sie einen magnetischen Rührer, um für eine Minute zu rühren. Warten Sie 15 Minuten, bis sich die Perlen absetzen, und dekantisieren Sie den Überstand.
Wiederholen Sie den Vorgang mit vorgekühltem PBS. Vornassdialysekassetten in PBS. Verwenden Sie eine Spritze, um die zuvor hergestellte Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Kassetten einzutragen.
Fügen Sie die PBS-behandelten Adsorbieren zu drei Litern PBS hinzu, und legen Sie die Kassetten in die PBS, um bei vier Grad Celsius zu dialysieren. Die Perlen halten den Dichtegradienten entlang der Dialysemembran konstant. Ändern Sie den Puffer und die Perlen nach einer Stunde und zwei Stunden.
Nach 24 Stunden, mit einer Spritze, extrahieren Sie die Lösung aus der Kassette in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr, um die rekonstituierte HDL-Partikellösung wiederherzustellen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. Versorgen Sie das Reaktionsrohr mit Inertgas, versiegeln Sie es und lagern Sie die rekonstituierte HDL-Partikellösung unter Inertgasatmosphäre bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie zunächst eine frische 30-Millimolar-Sperminlösung in RNAse-freiem Wasser vor. Mischen Sie 100 Mikroliter von 10 Mikromolaren synthetischer microRNA mit 100 Mikroliter Naperlösung in einem Zwei-Milliliter-Reaktionsröhre. Und für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius brüten.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter DMSO und 1,2 Milliliter 1X LDL Puffer in die vorbereitete microRNA-Sperminlösung. Verdünnen Sie die zuvor hergestellte LDL-Partikellösung mit PBS auf eine Endkonzentration von etwa vier Milligramm pro Milliliter. Dann 450 Mikroliter der verdünnten Lösung in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr ziehen und mit 50 Mikrolitern 10X LDL Puffer mischen.
10 Minuten auf Eis bebrüten. Kombinieren Sie nach der Inkubation die 500-Mikroliter-LDL-Partikellösung und die 1,5-Milliliter-Lösung microRNA-spermin-DMSO und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Führen Sie eine Dialyse ähnlich wie zuvor beschrieben durch und lagern Sie die beschriftete LDL-Partikellösung unter Inertgasatmosphäre bei vier Grad Celsius.
Verdünnen Sie zunächst die HDL- oder LDL-Partikellösung in PBS zwischen 1:100 und 1:000. Cleave Glimmer durch Drücken klebeband gegen das Glimmersubstrat, und ziehen Sie das Band ab, um die oberen Glimmerschichten zu entfernen. Verwenden Sie eine Pipette, um zwei Mikroliter auf frisch gespaltetem Glimmer zu legen, um für fünf Minuten zu brüten.
Lipoproteinpartikel neigen dazu, kontinuierliche Bindungsmembranen auf Oberflächen zu bilden. Daher ist es wichtig, die Partikelkonzentration auf der Glimmeroberfläche anzupassen, um einzelne zu erhalten. Nach der Inkubation die Probe mit PBS abspülen.
Füllen Sie die Hochgeschwindigkeits-AFM-Flüssigkeitszelle mit PBS und montieren Sie den Mica-tragenden Scanner auf die Hochgeschwindigkeits-AFM-Stufe. Starten Sie in der Steuerungssoftware den Annäherungsprozess des Auslegers an die Glimmeroberfläche. Verwenden Sie Scangrößen von weniger als einem Quadratmikrometer, und halten Sie die Bildkräfte so gering wie möglich.
Bildn das Beispiel im Tippmodus. Laden Sie die Daten in die Gwyddion, und erkennen Sie die Partikel über die Markierungskörner nach Schwellenfunktion. Passen Sie den Höhenschwellenwert an, um die einzelnen Partikel zu maskieren.
In der Regel ist ein Niveau um 50% ein guter Ausgangspunkt. Entfernen Sie den Polynomhintergrund, um das Bild abzuflachen, und aktivieren Sie die Option maskierte randalierte Bereiche ausschließen. Exportieren Sie die maximalen Höhenwerte der erfassten Partikel mithilfe der Verteilung der verschiedenen Korneigenschaften- und -schritte für alle aufgezeichneten Bilder.
In diesem Experiment wurde die Rekonstitution von HDL-Partikeln durch Delipidation von HDL-Partikeln durchgeführt, gefolgt von Relipidation und Dialyse. Eine Ausbeute von 50% der rekonstituierten HDL-Partikel kann erreicht werden. Die gleiche Kennzeichnung mit microRNA war jedoch aufgrund der Hydrophobie des Apolipoproteins B100 Proteins für die Kennzeichnung von LDL-Partikeln nicht möglich.
So wurde DMSO für das Eindringen der Lipidmonoschicht der LDL-Partikel verwendet, mit einer Ausbeute von fast 100%Während der Qualitätskontrolle ist die Verdünnung für die Analyse entscheidend. Das obere Bild zeigt eine zu hohe Partikeldichte. Das untere Bild eignet sich zur Analyse.
Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen von Partikelhöhen wurden für den Vergleich der Größenverteilungen der nativen, markierten und markierten Kontrolllipoproteinpartikel berechnet. Die relative Änderung vor und nach der Etikettierung ist vernachlässigbar. Beim Umgang mit RNA-Oligonukleotiden arbeiten RNAse-frei.
Verwenden Sie frische Einweg-Kunststoff-Verbrauchsmaterialien und tragen Sie immer Handschuhe. Verwenden Sie nur nukleasefreie Lösungen. High-Speed-AFM ist nur eine Methode, um die allgemeine Form von Lipoproteinen zu bestimmen.
Eine alternative Methode wäre die Elektronenmikroskopie. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, und arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube beim Umgang mit Demethylether.
