Name: using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
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This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.

1. Wartung der Caco-2-Zellen <ol><li> Verwenden von regulären Gewebekulturschalen <ol><li> Tauen die Caco-2-Zellen, die aus einem gefrorenen Fläschchen durch Platzieren des Gefäßes in einem 37 ° C Wasserbad, und fügen Sie sie sofort auf eine 10 cm Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmten Wachstumsmedien (15% fötalem Rinderserum (FBS ) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM)). <ol><li> Wenn die Caco-2-Zellen 50-70% Konfluenz erreicht, spalteten sich 1: 6, indem die Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin / 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C, bis sie abgenommen werden (15 min) . Zu Zelle Verklumpung zu vermeiden, mischen Sie die Zellen mehrfach durch vorsichtiges Pipettieren. 0,5 ml der Trypsin-Zellen auf eine 10 cm-Gewebekulturschale mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium. </li></ol></li><li> Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Vermeiden Sie wirbeln die Gerichtewie es in einer ungleichen Zelldispersion führen. </li><li> Die Schalen werden auf eine flache Oberfläche in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 zugeführt wird. Geneigten Flächen kann auch in einer ungleichen Zelldispersion führen. </li><li> Ändern Sie den Wachstumsmedien einen Tag nach Beginn der Inkubation. </li><li> Überwachen Sie die Zellen, und notieren Sie den Tag ihrer Zusammenfluss zu erreichen. Es wird ca. 1 Woche dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz ab dem Tag sie aufgeteilt werden zu erreichen. </li><li> Ändern Sie den Wachstumsmedien zweimal pro Woche, bevor die Zellen Konfluenz erreichen. Sobald die Zellen Konfluenz erreicht, ändern Sie die Wachstumsmedien jeden zweiten Tag. Nachdem die Zellen 7 Tage post-konfluente, ändern Sie die Wachstumsmedien täglich. Anmerkung: Die Zellen sind bereit für Experimente, wenn sie 13 Tage nach der Konfluenz (Abbildung 1). Da die Zellen werden schließlich weniger wirksam in der Herstellung von Lipoproteinen, verwenden Zellen, die zwischen 13 bis 17 Tage post-konfluente 8 sind. Zum, wie man das Experiment durchführen Schritt 3.</li></ol></li><li> Verwendung der permeablen Membransystem <ol><li> Samen der Caco-2-Zellen in der durchlässigen Membran Einsatz wie in Schritt 1.1.1.1 beschrieben. über. Vermeiden Sie Zellen aus einem zugefrorenen Fläschchen, weil ihre Zellwachstum ist in der Regel langsamer (Erholungszeit). Kurz gesagt, werden 0,5 ml der Zellen mit Trypsin behandelt, um die apikale Kammer (Oberkammer), die mit 10 ml vorgewärmtem Nährmedium enthält. Außerdem werden 10 ml des vorgewärmten Nährmedium zur basolateralen Kammer (unteres Fach). Hinweis: Für Best Practice, fügen Sie die Wachstumsmedien zur apikalen Kammer und dann zur basolateralen Kammer. Beim Entfernen der alten Medien, entfernen Sie den basolateralen Medien vor den apikalen Medien. Vermeiden Stossen die Polycarbonatmembran, da es die Membran reißen. </li><li> Aufgrund der schlechten Sicht durch die Zelle Polycarbonatmembran, Saatgut die Caco-2-Zellen in einem normalen Gewebekulturschale mit ähnlicher Dichte, und verwenden Sie dieses Gericht, das Zellkonfluenz beurteilen. </li><li> Folgen Sie sTEPs 1.1.2-1.1.6 oben. </li></ol></li></ol> 2. Genüberexpression <ol><li> Mit Hilfe der regulären Transfektionsansatz <ol><li> Samen der Caco-2-Zellen auf einer Gewebekulturschale wie oben in 1.1.1.1.-1.1.4 beschrieben. Hinweis: Wenn die Zellen etwa 40-50% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie. </li><li> Hinzuzufügen 67 ul des Transfektionsreagenz auf 472 &amp; mgr; l der reduzierten Serum-Medium in einem Reaktionsgefäß. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden. </li><li> Hinzuzufügen 23 ug pLL3.7 enhanced green fluorescent protein (eGFP) 9 in das Transfektionsreagenz / reduziert Serum Mediengemisch. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT. </li><li> Ersetzen Sie die Caco-2-Zellen &quot;Wachstumsmedien mit 8 ml 10% FBS in DMEM. </li><li> Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale. </li><li> Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und backward Richtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. </li><li> Die Schale in der 37 ° C-Inkubator. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 10 ml Wachstumsmedium einen Tag nach Beginn der Inkubation. </li><li> Überwachen Sie die Genexpression. <ol><li> Überwachen Sie die Genexpression ohne 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung. Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, bestimmen den Prozentsatz der Zellen, die grün sind. Der Anteil stellt die Transfektionseffizienz. </li><li> Überwachen Sie die Genexpression mit DAPI-Färbung. <ol><li> Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dreimal Waschen der Zellen. </li><li> Fixieren die Zellen durch Zugabe von 10 ml von 4% Formaldehyd in PBS (10 min Inkubation bei RT). </li><li> Dreimal mit PBS waschen der Zellen. </li><li> Die Zellen im Dunkeln inkubieren für 15 min bei RT mit 8 ml PBS, das 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% Digitonin. </li><li> Dreimal mit PBS waschen der Zellen. </li><li> Usingen ein Fluoreszenzmikroskop, bestimmen die Anzahl der Zellen, die grün / blau im Vergleich zu denen, die blaue (Abbildung 2 oberes Feld) sind. Der errechnete Prozent stellt die Transfektionseffizienz. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Verwenden des Lentivirus Expression System 10 <ol><li> Seed menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T-Zellen in einer 15 cm Gewebekulturschale (10% FBS in DMEM als Wachstumsmedien). Hinweis: Wenn die Zellen etwa 60-70% konfluent, bereit, transfiziert werden, sind sie. </li><li> Fügen Sie 162 ul der Transfektionsreagenz auf 1.133 &amp; mgr; l der reduzierten Serum-Medien in ein Mikrozentrifugenröhrchen 11. Kontakt mit unverdünntem Transfektionsreagenz mit der Rohrwand zu vermeiden. </li><li> In 24 ug pLL3.7 eGFP (oder ein anderes Konstrukt), 15,6 ug Rev-Response-Element (RRE), 6,0 &amp; mgr; g REV, und 8,4 ug des vesikulären Stomatitis-Virus-Glykoprotein (VSVG) in das Transfektionsreagenz / reduced Serum Medienmischung. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 20 min bei RT. </li><li> Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 16 ml 10% FBS in DMEM. </li><li> Fügen Sie die DNA / Transfektionsreagenz / reduziert Serum Medien Mischung tropfenweise in die Schale. </li><li> Schütteln Sie das Geschirr mehrmals in einer Vorwärts- und Rückwärtsrichtung, gefolgt von einer linken und rechten Richtung. Es ist normal, einige der HEK293T-Zellen freistehend an dieser Stelle zu sehen. </li><li> Die Schale in den Inkubator. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, ersetzen Sie die Medien in der Schale mit 25 ml Wachstumsmedium. </li><li> Am folgenden Tag, sammeln das Wachstumsmedium, das die Lentivirus (erste Kollektion). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2.10 mehr Lentivirus (die zweite Sammlung) zu sammeln. </li><li> Bündeln die erste und die zweite Sammlung, und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation (2500 × g für 5 min). </li><li> Filtern Sie die Sammlung mit einem Einweg-Flaschenaufsatz-Filter (0,45 um Poren) undKonzentrat, das Virus durch Zentrifugation der Sammlung 31.400 × g für 2 Stunden bei RT (JA-20-Rotor). Markieren den Boden des Zentrifugenrohrs, wo das Pellet entfernt. Den Überstand umfüllen, und lassen Sie das Rohr bei RT invertiert für etwa 15 min. </li><li> Resuspendieren virushaltige Pellet mit 100 ul 1X PBS. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Bewahren Sie die konzentrierte Virus bei -80 ° C. Vermeiden Einfrieren und Auftauen. </li><li> Bestimmung der optimalen Menge des Virus benötigt, um die Caco-2-Zellen durch Titration zu transduzieren. Um Kosten zu sparen, verwenden Sie eine 24-Well-Platte (0,3 ml Wachstumsmedium / well) anstelle eines 10 cm Gewebekulturschale für die Titration. <ol><li> Hinzuzufügen zunehmenden Mengen des konzentrierten Virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, und 50 ul / Vertiefung), ergänzt mit Polybren (Endkonzentration = 5 &amp; mgr; g / ml) auf 40-70% konfluent Caco-2-Zellen. Schütteln Sie die Platte mit 24 Vertiefungen vorsichtig wie in 1.1.2 beschrieben. </li><li> Überwachung ihrer Genexpression (Schritt 2.1.10.) (Abbildung 2 unten4 Platten). </li></ol></li><li> Da die Expression des Transgens in der Regel aufrechterhalten, pflegen die transduzierten Zellen für zukünftige Experimente und ihre Genexpression kontinuierlich zu überwachen (Schritt 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Förderung der Lipoproteinsekretion <ol><li> Mit Hilfe der regulären Gewebekulturschale <ol><li> Vorbereitung einer 100X Lipidgemisch durch Mischen von 50 mg Ölsäure 40 mg Lecithin und 48 mg Natriumtaurocholat. Bringen Sie die Lautstärke auf 900 ul mit PBS (ausreichend für 8 Geschirr). Mischen Sie den Lipidmischung kräftig. </li><li> Add 900 ul 100X Lipidgemisch in 89,1 ml Wachstumsmedium. Zu mischen, und Filtern der lipidhaltigen Medien. Die Endkonzentrationen (1X) Ölsäure, Lecithin und Natriumtaurocholat sind 2,0 mM, 1,36 mM und 1,0 mM. </li><li> 10 ml des lipidhaltigen Medien zu den Zellen. </li><li> Die Zellen mit dem lipidhaltigen Medien Inkubieren 4 Stunden in eine 37° C Inkubator. </li><li> Dreimal mit PBS waschen der Zellen. </li><li> 10 ml Wachstumsmedium zu den Zellen, um die Lipoproteinsekretion sammeln. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. </li><li> Sammeln Sie die Lipoprotein-haltigen Medien. </li></ol></li><li> Verwendung der permeablen Membransystem <ol><li> Führen Sie die Schritte, um den Lipid 3.1.1-3.1.2 Mischung herzustellen. </li><li> 10 ml des lipidhaltigen Medien zur apikalen Kammer und 10 ml des Wachstumsmediums zur basolateralen Kammer. </li><li> Inkubieren für 4 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. Sammeln Sie die Lipoprotein enthaltenden Medien in der basolateralen Kammer. </li></ol></li></ol> 4. Lipoprotein Isolation (Abbildung 3) <ol><li> Entfernen der Zelltrümmer aus der Lipoprotein enthaltenden Medien durch Zentrifugation (2.000 × g für 5 min). </li><li> Dekantieren Sie das Medium in einen 50-ml-Tube. </li><li> Hinzuzufügen 5,95 g Natriumchlorid zu den Medien. </li><li> Wenn der sample wird durch die TEM untersucht werden, fügen 1 Proteaseinhibitor-Cocktail-Tablette, die Integrität der Lipoproteine ​​aufrechtzuerhalten. </li><li> Bringen Sie die Lautstärke auf 23 ml mit Wasser (1,2 g / ml NaCl-Lösung Dichte). </li><li> Lösen sich die gelösten Stoffe vollständig. </li><li> Dekantiert die gesamte Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat. </li><li> Überlagern Sie vorsichtig die 1,2 g / ml Dichte Lösung mit 0,5 ml Wasser (1,0 g / ml Dichte). </li><li> Gleichgewicht der Röhre beträgt und nicht auf das Volumen. </li><li> Die Rohre in dem T865 Rotor sanft zu laden. </li><li> Dreh die Proben in der Ultrazentrifuge bei 429.460 xg für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Sofort isolieren die Spitze 0,5 ml Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. Halten Sie das Rohr so ​​ruhig wie möglich. </li></ol> 5. TEM-Analyse <ol><li> Vorbereitung 5 ml 2% Phosphorwolframsäure (w / v) und der pH-Wert auf 6,0. </li><li> Filtern Sie die 2% Phosphorwolframsäure mit einem Spritzenfilter (Porengröße: 0,2 um). </li><li> Drop 20 ul der Probe auf einem Lipoprotein sterile Schüssel. </li><li> 20 ul Tropfen der filtrierten 2% Phosphorwolframsäure neben der Probe auf der gleichen Schale. </li><li> Fallen sanft ein EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der Probe aufliegt. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min. </li><li> Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Probe aus dem Netz zu entfernen. </li><li> Drop Sie vorsichtig die EM Gitter mit der stumpfen Seite auf der 2% Phosphorwolframsäure ruhen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min. </li><li> Klopfen Sie leicht die Seite des EM Gitter auf einem Filterpapier, um die Phosphorwolframsäure aus dem Netz zu entfernen. </li><li> Verwendung eines TEM, erfassen die Bilder der Lipoproteine ​​(Abbildung 4). </li></ol>

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The author has nothing to disclose.

In diesem Papier, um die beiden Systeme, die verwendet werden können, zu erhalten Caco-2-Zellen beschrieben werden, nämlich die normale Gewebekulturschale und die durchlässige Membran. Die Vorteile der Verwendung der permeablen Membransystem umfassen die Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten, und die Fähigkeit, das Lipid-Mischung zu inkubieren, und gleichzeitig sammelt die Lipoproteinsekretion. Jedoch sind die durchlässigen Membraneinsätze teuer, und ihre Polycarbonat-Membran nicht für eine gute Sichtbarkeit Zelle ermöglichen. Einer der Vorteile von diesem in vitro-Modell ist, dass die genetische Manipulation Studien wirtschaftlich und weniger zeitaufwändig sein. Für eine Verbesserung der Wirksamkeit sollte der Lentivirus-Expressionssystem verwendet werden. Die transduzierten Caco-2-Zellen in der Regel halten die Ausdruck ihrer Transgens. Die Fähigkeit von Caco-2-Zellen zu erzeugen Chylomikronen ist von größter Bedeutung. Ohne diese Fähigkeit würde Caco-2-Zellen nicht in der Lage sein efficiently transportieren lipophilen Materialien, einschließlich aber nicht beschränkt auf lipophile Wirkstoffe, Vitamin A, D, E und K, sowie alle lipidlösliche Nährstoffe begrenzt. Die richtigen Methoden zu Caco-2-Zellen herausfordern zu produzieren beide VLDL-Partikel und Chylomikronen werden beschrieben. Die erfolgreiche Isolierung dieser Lipoprotein-Partikel sollten auf einem TEM bestätigt werden. Auf der Grundlage der aktuellen Literatur bietet dieses Caco-2-Modell die effizienteste Lipidtransport unter anderem Caco-2-Modelle 12-14. Allerdings ist die in vivo Lymphe Kanülierung Modell noch transportiert Lipide effizienter als jede in vitro-Modell. Die Gründe hierfür sind vor kurzem diskutiert 8, nämlich weil Caco-2-Zellen produzieren 2 verschiedene Isoformen von Apolipoprotein B, Caco-2-Zellen nicht Triglyceriden aus Monoglyceriden synthetisieren kann und die Serumkomponente kritisch für Chylomicron Biogenese niedriger im Wachstumsmedium sein . Es ist auch wichtig, um die Begrenzung der in dieser Realisierungvitro-Modell; Dieses in vitro-Modell schließt einige potentielle wichtige Faktoren wie Darmmotilität Anatomie der Darm und die Wechselwirkung mit anderen Organsystemen. Die Hauptfaktoren, die Caco-2-Zellen zu produzieren Chylomikronen ermöglichen effizient sind die Art / Menge der verwendeten Lipide und Zelldifferenzierung 8. Ohne die richtige Kombination dieser Faktoren wird Caco-2-Zellen keine signifikante Anzahl von Chylomikronen 8 herzustellen. Zu beachten ist, sollte NaCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ordnungsgemäß durchgeführt werden. Die erfolgreiche Isolierung der Lipoproteine, hängt von Zeitpunkt (sofort ohne nennenswerte Verzögerung), gute Probenhandling (robust, ohne viel Unruhe) und sorgfältiger Pipettierung (immer nur die oberste Schicht). Richtige Technik kann durch die Verwendung vorgefärbter Lipide zu helfen visualisieren die Lipoprotein-Schicht 8 durchgeführt werden. Neben TEM, biochemische Analysen, das heißt, Apolipoprotein B und Triglycerid-Analysen, auch U sein kannsed, um die erfolgreiche Isolierung der Lipoproteine ​​zu bestätigen. Diese biochemischen Analysen, die wir bereits berichtet haben, 8, kann auch als Methoden der Quantifizierung Aufnahme dienen. Jedoch sollte TEM noch aufgrund der Tendenz der Lipoproteine ​​geführt werden, um zu aggregieren 2, was zu einer Überschätzung der potentiellen chylomicron Produktion. Diese in vitro-Modell ist besonders nützlich für das Studium Nahrungsfettabsorption und die intestinale Absorption von lipophilen Arzneimitteln, Vitaminen und anderen lipidlöslichen Nährstoffen. Es kann auch als ein Modell der schlechten Bioverfügbarkeit von oral lipophile Medikamente zu verbessern dienen. Da lipidlöslichen Materialien in Chylomikronen durch Enterozyten für den Transport zur Zirkulation verpackt werden Chylomikronen produzierenden Caco-2-Zellen effizienter absorbieren lipophile Medikamente. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell Ermittler, um die Rolle eines bestimmten Gens in der Medikamentenabsorption durch die Darm (Pharmakogenetik) zu bestimmen. Es ermöglicht auch investigators um die Wirkung verschiedener Nahrungsfette auf die orale Bioverfügbarkeit lipophiles Arzneimittel zu vergleichen. Alle diese Anwendungen haben die zuvor 6 erörtert.

4 - Studien der intestinalen Aufnahme von Nahrungsfett und lipidlösliche Arzneimittel und Vitamine können in vivo unter Verwendung eines Lymphfistel Modell 1 durchgeführt werden. Jedoch sind die Operationstechniken involviert nicht nur anspruchsvoll, sondern auch kostspielig. Obwohl in vivo-Ansätzen auf fäkale Analysen können verwendet werden, basieren, sind sie hauptsächlich verwendet, um die prozentuale Aufnahme durch den Magen-Darm-2,5 bestimmen. Die in diesem Dokument beschriebenen in vitro-Modell ist kostengünstiger, und die Techniken beteiligt sind wohl weniger anspruchsvoll. Genetische Veränderung Studien sind auch wirtschaftlicher und weniger zeitaufwendig, wenn sie mit diesen in-vitro-Modell durchgeführt. Da lipidlöslichen Materialien, die von Enterozyten genommen werden, in Lipoproteinen 6,7 verpackt ist, wird die Wirksamkeit dieser in vitro-Modell zu erzeugen Lipoproteine ​​entscheidend. Die zwei Haupt intestinal Lipoproteine ​​Chylomikronen und sehr geringer Dichte (VLDL). Chylomikronen, definiert als Lipoproteine ​​mit 80 nm oder mehr im Durchmesser, werden ausschließlich durch den Dünndarm produziert, wenn Lipide in Fülle im Magen-Lumen vorhanden sind. Da sie die größte Lipoproteine ​​Chylomikronen sind denkbar die effizientesten Lipidtransportern. Dieses in vitro-Modell, das in der Lage ist Chylomikronen 8 kann verwendet werden, um Nahrungsfettabsorption, lipidlösliches Vitamin Absorption durch den Darm und die orale Bioverfügbarkeit lipophiles Arzneimittel zu untersuchen. Die Anwesenheit von lipidlösliche Moleküle, Vitamine oder Drogen in der Lipoproteinfraktion ist ein Indikator für deren Absorption durch den Dünndarm. Wie zuvor erläutert, kann dieses Modell verwendet werden, um die orale Bioverfügbarkeit lipophilen Arzneimittel 6 zu verbessern. Dieses Papier beschreibt, wie Caco-2-Zellen sollten in durchlässige Membran oder regelmäßige Gewebekulturschalen, wie die Lipid-mi beibehalten werdenBefestigung zur Stimulierung Lipoproteinsynthese sollten darauf vorbereitet sein, wie die Lentivirus-Expressionssystem verwendet werden, um effektiv eine Überexpression zu erreichen, und wie die isolierte Lipoproteine ​​sollten analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>We do not heat inactivate our serum</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permeable membrane system</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Tissue culture dish</td></tr><tr><td>15 cm dish</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Tissue culture dish</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Tissue culture plate</td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Can be substituted with other transfection reagent</td></tr><tr><td>Reduced serum media</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>For transfection</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.addgene.org/11795/&quot;&gt;https://www.addgene.org/11795/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Bottle-top filter</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>0.45 mm pore</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Prevent freeze-thaw cycle</td></tr><tr><td>Lecithin&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Egg lecithin&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium taurocholate</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Used mainly for samples that need TEM analysis</td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Reusing it multiple times will collapse the tube</td></tr><tr><td>Lid for ultracentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>A tool is required to remove the tube/lid from rotor</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Disposable</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Pore size = 0.2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0</td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fine and strong tips</td></tr><tr><td>Formvar/carbon grid</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/carbon film square grid 400 Copper</td></tr></tbody></table>

using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Abbildung 1 zeigt die normale 13-Tage nach der konfluenten Caco-2-Zellen. Das Aussehen des kuppelförmigen Strukturen und intrazellulären Lipidtröpfchen Charakteristik unterschieden Caco-2-Zellen. Wenn die Caco-2-Zellen werden nicht in gleicher Weise während der Aussaat dispergiert werden sie verklumpen und wuchern in bestimmten Bereichen der Schale; und es gibt ein paar Bereiche in der Schale ohne Zellen sein. Wirbelnden und Platzieren der Schale auf einer schrägen Fläche zu vermeiden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass postkonfluente Caco-2-Zellen sind anfälliger für Ablösung, wenn neue Wachstumsmedium zu den Zellen zu grob gegeben. Deshalb sollten die neuen Medien vorsichtig zugegeben werden, um Zellablösung zu verhindern. Basierend auf diesen Studien wurde die Transfektionseffizienz von Caco-2-Zellen, die zwischen 30-60% (Abbildung 2 oben Panels). Im Gegensatz dazu war die Transduktionseffizienz von Caco-2 mit dem Lentivirus-Expressionssystem ca. 100% (Abbildung 2 </strong&gt; Bodenpaneele), Fig. 2 zeigt auch, dass die optimale Menge an konzentrierter Lentivirus betrug 10 ul. Die transduzierten Caco-2-Zellen wurden bis zu 12 Passagen aufrechterhalten. Wie gezeigt, immer noch zum Ausdruck auch nach 12 Durchgängen die transduzierten Zellen eGFP. Die Transduktionseffizienz hängt eindeutig von der Lentivirus-Konzentration. Die Bestätigung der Transfektion / Transduktion ist kritisch und sollte als eine Routine Voranalyse vor den eigentlichen Experimente durchgeführt werden. Obwohl Western Blot-Analyse kann verwendet werden, um die prozentuale Steigerung der Genexpression zu schätzen, sollte es nicht die wichtigste Methode, um die Transfektion / Transduktion bestimmen. Verwendung des NaCl-Dichtegradienten Ultrazentrifugationsverfahren (Abbildung 3), wurden die Lipoproteine ​​von den Caco-2-Zellen sezerniert isoliert und auf einem TEM analysiert. Einige der Chylomikronen, Lipoproteinen größer als 80 nm im Durchmesser wurden in Abbildung4. Die kleineren Lipoproteine ​​VLDL, waren ebenfalls anwesend. Es ist wesentlich für die erfolgreiche Isolierung von beiden Chylomikronen und VLDL auf einem TEM bestätigen. Wie zuvor diskutiert 8 sollten biochemische Analyse nicht die primäre Methode der Bestätigung. Das Fehlen von Lipoproteinen, insbesondere Chylomikronen zeigt, dass der Lipidtransport durch die Caco-2-Zellen nicht effizient ist. Folglich werden sie nicht als ein gutes Modell, um Lipidtransport untersuchen zu dienen. Die Anzahl der Chylomikronen Teilchen bezogen auf die Gesamtzahl der Lipoproteinteilchen gezählt 8 werden. Ein hoher Prozentsatz zeigt effiziente Lipidtransport. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig1.jpg" /> Figur 1. Repräsentative mikroskopische Aufnahme 13tägigen postkonfluente Caco-2-Zellen. Die intrazelluläre Lipidtröpfchen in einigen Zellen (roter Pfeil) sichtbar. Die einzigartige kuppelförmige Strukturen (schwarzer Pfeil) fovon einigen Caco-2-Zellen Rmed generell nur vorhanden, nachdem die Zellen Konfluenz erreicht. Vergrößerung = 100X. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53086/53086fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich der Wirksamkeit der Lipidbasis Transfektion und Lentivirus Expressionssystem Deckplatte:. Caco-2-Zellen wurden mit pLL3.7 eGFP unter Verwendung des nicht-liposomalen Transfektionsreagenz (Maßstab = 20 &amp; mgr; m) transfiziert. Bodenplatten 4: Caco-2-Zellen wurden mit pLL3.7 eGFP Verwendung der Lentivirus-Expressionssystem mit verschiedenen Mengen (1, 2, 5 oder 10 ul) der konzentrierten Lentivirus (LV) transduziert. Die dargestellten Zellen wurden von der 12-ten Durchlauf der Original transduzierten Zellen. Die linke Felder zeigen die DAPI-Färbung, die mittlere panels zeigen die GFP-Fluoreszenz und die richtigen Felder zeigen die zusammengeführten Bilder. Die Lentiviren Expressionssystem war offenbar wirksamer als die lipidbasierten Transfektion. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53086/53086fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig3.jpg" /> Figur 3. Isolierung von Darm Lipoproteine ​​mit NaCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die Dichte-Lipoprotein-haltigen Medien ist auf 1,2 g / ml durch Zugabe der entsprechenden Menge von NaCl eingestellt. Das Volumen der Probe muss auch eingestellt werden, so dass es den gesamten Ultrazentrifugenrohrs, um einen Zusammenbruch zu verhindern, zu füllen. Um einen Dichtegradienten zu erreichen, wird mit 0,5 ml Wasser vorsichtig auf 1,2 g / ml Dichte Lösung überschichtet. Die Probe wird dann bei 429.460 × g für 24 Stunden unter Verwendung eines T865 gesponnenRotor (äquivalent zu 2,15 Svedberg-Einheiten). Die Darm Lipoproteine ​​sollten sofort durch vorsichtiges Pipettieren gewonnen werden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53086/53086fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig4.jpg" /> Figur 4. Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahme der durch die Caco-2-Zellen hergestellt Lipoproteine. Die Lipoproteine ​​NaCl Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden negativ mit 2% Phosphorwolframsäure (pH 6,0) gefärbt. Chylomikronen, Lipidpartikel größer als 80 nm im Durchmesser und VLDL, denen weniger als 80 nm, beide vorhanden sind. Maßstabsbalken = 100 nm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53086/53086fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Aufrufe.  California Northstate University. Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Serie: Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of cellular membranes, apoptosis and necrosis 1. Cells can source cholesterol from intracellular synthesis and from plasma lipoproteins, both sources are sufficient to fully satisfy cells' requirements for cholesterol. The processes of cholesterol synthesis and uptake are tightly regulated and deficiencies of cholesterol are rare 2. Excessive cholesterol is more common problem 3. With the exception of hepatocytes and to some degree adrenocortical cells, cells are unable to degrade cholesterol. Cells have two options to reduce their cholesterol content: to convert cholesterol into cholesteryl esters, an option with limited capacity as overloading cells with cholesteryl esters is also toxic, and cholesterol efflux, an option with potentially unlimited capacity. Cholesterol efflux is a specific process that is regulated by a number of intracellular transporters, such as ATP binding cassette transporter proteins A1 (ABCA1) and G1 (ABCG1) and scavenger receptor type B1. The natural acceptor of cholesterol in plasma is high density lipoprotein (HDL) and apolipoprotein A-I. 
The cholesterol efflux assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells. It measures the capacity of cells to maintain cholesterol efflux and/or the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of the following steps. Step 1: labelling cellular cholesterol by adding labelled cholesterol to serum-containing medium and incubating with cells for 24-48 h. This step may be combined with loading of cells with cholesterol. Step 2: incubation of cells in serum-free medium to equilibrate labelled cholesterol among all intracellular cholesterol pools. This stage may be combined with activation of cellular cholesterol transporters. Step 3: incubation of cells with extracellular acceptor and quantitation of movement of labelled cholesterol from cells to the acceptor. If cholesterol precursors were used to label newly synthesized cholesterol, a fourth step, purification of cholesterol, may be required.
The assay delivers the following information: (i) how a particular treatment (a mutation, a knock-down, an overexpression or a treatment) affects the capacity of cell to efflux cholesterol and (ii) how the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol is affected by a disease or a treatment. This method is often used in context of cardiovascular research, metabolic and neurodegenerative disorders, infectious and reproductive diseases.

The cholesterol assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells and the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of labelling cells with cholesterol, equilibration of cholesterol among intracellular pools and release of cholesterol to an extracellular acceptor.

Cholesterin Efflux-Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Forschung

Medizin

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Biotechnik

Exploring the Regulation of Lipid Droplet Catabolism through Lipophagy

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This process is particularly prominent under conditions such as fasting, cellular stress, organelle damage, cellular damage, or aging of cellular components. During autophagy, a segment of the cytoplasm is enclosed within double-membrane vesicles known as autophagosomes, which then fuse with lysosomes. Following this fusion, the contents of autophagosomes undergo non-selective bulk degradation facilitated by lysosomes. However, autophagy also exhibits selective functionality, targeting specific organelles, including mitochondria, peroxisomes, lysosomes, nuclei, and lipid droplets (LDs). Lipid droplets are enclosed by a phospholipid monolayer that isolates neutral lipids from the cytoplasm, protecting cells from the harmful effects of excess sterols and free fatty acids (FFAs). Autophagy is implicated in various conditions, including neurodegenerative diseases, metabolic disorders, and cancer. Specifically, lipophagy -- the autophagy-dependent degradation of lipid droplets -- plays a crucial role in regulating intracellular FFA levels across different metabolic states. This regulation supports essential processes such as membrane synthesis, signaling molecule formation, and energy balance. Consequently, impaired lipophagy increases cellular vulnerability to death stimuli and contributes to the development of diseases such as cancer. Despite its significance, the precise mechanisms governing lipid droplet metabolism regulated by lipophagy in cancer cells remain poorly understood. This article aims to describe confocal imaging acquisition and quantitative imaging analysis protocols that enable the investigation of lipophagy associated with metabolic changes in cancer cells. The results obtained through these protocols may shed light on the intricate interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression. By elucidating these mechanisms, novel therapeutic targets may emerge for combating cancer and other metabolic-related diseases.

Lipophagy is a selective form of autophagy that involves the degradation of lipid droplets. Dysfunctions in this process are associated with cancer development. However, the precise mechanisms are not yet fully understood. This protocol describes quantitative imaging approaches to better understand the interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression.

Erforschung der Regulation des Lipidtröpfchen-Katabolismus durch Lipophagie

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This ...

Krebsforschung

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

Eine Kokulturen Methode zu untersuchen, das Übersprechen zwischen den x-ray bestrahlten Caco-2 Zellen und PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Immunologie und Infektion

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the outer leaflet drives the membrane&#39;s propensity to form lipid rafts. The transient nature of lipid rafts makes it difficult to study in living cells. Therefore, methods that add or remove raft-forming lipids at&#160;the outer leaflet of living cells facilitate studying the characteristics of rafts, such as their effects on membrane proteins. Lipid exchange experiments developed in our lab utilize lipid-loaded cyclodextrins to remove and add exogenous phospholipids to change the lipid constitution of the plasma membrane. Substituting the membrane with a raft or non-raft-forming lipid can aid in studying the effects on transmembrane protein activity. Here, we describe a method for lipid exchange on the outer leaflet of the plasma membrane using lipid-loaded cyclodextrin. We demonstrate the preparation of the exchange media and the subsequent treatment of attached mammalian cells. We also showcase how to measure the efficiency of exchange using HP-TLC. This protocol yields a nearly complete replacement of the outer leaflet with exogenous lipids without altering cellular viability, permitting further experimentation on modified intact plasma membranes.

We describe a method for using cyclodextrin to mediate exchange between lipids of the plasma membrane with exogenous lipids. This technique can be paired with experiments studying transmembrane proteins, which behave differently in lipid raft-like environments than they do in non-raft-like environments.

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Biochemie

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) molecules, before they are packaged into chylomicrons for transport to the lymph or into cytosolic lipid droplets (LDs) for intracellular storage. A crucial step for the formation of LDs is the catalytic activity of diacylglycerol acyltransferases (DGAT) in the final step of TG synthesis. LDs are important to buffer toxic lipid species and regulate cellular metabolism in different cell types. Since the human intestinal epithelium is regularly confronted with high concentrations of lipids, LD formation is of great importance to regulate homeostasis. Here we describe a simple assay for the characterization and quantification of LD formation (LDF) upon stimulation with the most common unsaturated fatty acid, oleic acid, in human intestinal organoids. The LDF assay is based on the LD-specific fluorescent dye LD540, which allows for quantification of LDs by confocal microscopy, fluorescent plate reader, or flow cytometry. The LDF assay can be used to characterize LD formation in human intestinal epithelial cells, or to study human (genetic) disorders that affect LD metabolism, such as DGAT1 deficiency. Furthermore, this assay can also be used in a high-throughput pipeline to test novel therapeutic compounds, which restore defects in LD formation in intestinal or other types of organoids.

This protocol describes an assay for the characterization of lipid droplet (LD) formation in human intestinal organoids upon stimulation with fatty acids. We discuss how this assay is used for quantification of LD formation, and how it can be used for high throughput screening for drugs that affect LD formation.

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Biologie

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing a barrier to foreign particles. Impaired epithelial transport (ion, nutrient, or drugs) has been associated with many diseases and can have consequences that extend beyond the normal physiological functions of the transporters, such as by influencing epithelial integrity and the gut microbiome. Understanding the function and regulation of transport proteins is critical for the development of improved therapeutic interventions. The biggest challenge in the study of epithelial transport is developing a suitable model system that recapitulates important features of the native intestinal epithelial cells. Several in vitro cell culture models, such as Caco-2, T-84, and HT-29-Cl.19A cells are typically used in epithelial transport research. These cell lines represent a reductionist approach to modeling the epithelium and have been used in many mechanistic studies, including their examination of epithelial-microbial interactions. However, cell monolayers do not accurately reflect cell-cell interactions and the in vivo microenvironment. Cells grown in 3D have shown to be promising models for drug permeability studies. We show that Caco-2 cells in 3D can be used to study epithelial transporters. It is also important that studies in Caco-2 cells are complemented with other models to rule out cell specific effects and to take into account the complexity of the native intestine. Several methods have been previously used to assess the functionality of transporters, such as everted sac and uptake in isolated epithelial cells or in isolated plasma membrane vesicles. Taking into consideration the challenges in the field with respect to models and the measurement of transport function, we demonstrate here a protocol to grow Caco-2 cells in 3D and describe the use of an Ussing chamber as an effective approach to measure serotonin transport, such as in intact polarized intestinal epithelia.

We describe simple methods to study the regulation of intestinal serotonin transporter (SERT) function and expression using an in vitro cell culture model of Caco-2 cells grown in 3D&#160;and an ex vivo model of mouse intestines. These methods are applicable to the study of other epithelial transporters.

Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

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