Das Hauptziel der Entwicklungsbiologie ist es, die kontextspezifische Rolle eines Gens zu verstehen. Und dies kann durch konventionelle Knockout-Mutanten oder durch konstitutive Überausdruckslinien schwierig zu erreichen sein. Wir verwendeten das modulare Green Gate Klonsystem, um eine Ressource für induzierbare zytospezifische Expression in den drei Hauptmeristemen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu erzeugen.
Mit der gleichen modularen Klonstrategie kann diese Methode auf andere Pflanzenarten angewendet werden, die für die Transformation unveränderlich sind. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist wertvoll, da die Analyse der Wirkung der Transaktivierung in den Meristems des Stammes und der kurzen Spitze eine Zerlegung vor der Bildgebung erfordert, was ziemlich schwierig sein kann. Um zu beginnen, sterilisieren Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Als nächstes bereiten Sie halbfeste Murashige und Skoog Medium bei pH 5,8 und fügen Sie ein Prozent Saccharose und 0,9% Agar. Nach dem Autoklavieren Dex in DMSO gelöst in einer Endkonzentration zwischen 10 und 30 Mikromolaren zu den Induktionsplatten hinzufügen. Fügen Sie den Steuerplatten eine gleiche Menge DMSO hinzu.
Legen Sie die Samen für die Wurzelbildgebung auf Teller und schichten Sie sie für 48 Stunden in der Dunkelheit und bei vier Grad Celsius. Die Platten in eine vertikale Position in einen Pflanzenbrutschrank geben und fünf Tage lang anbauen. Fünf Tage nach der Keimung verwenden Sie die konfokale Laserscanmikroskopie, um die Sämlinge abzubilden.
Zu Beginn bereiten und wachsen Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben. Sechs bis sieben Tage nach der Keimung jeden Sämling in einem separaten Topf auf den Boden geben. Wenn Sie die Pflanzen durch Gießen induzieren, verwenden Sie eine 25 Mikromolar DEX Lösung in Wasser, hergestellt aus einem Bestand von 25 Millimolar DEX in Ethanol gelöst.
Wasser alle zwei bis drei Tage bis zur gewünschten Induktionszeit. Bei induzieren durch Tauchen, bereiten Sie einen Ein-Liter-Becher mit 750 Milliliter Wasser, das 0,02%Silwet L77 und DEX bei 25 Mikromolar Endkonzentration oder eine entsprechende Menge dmSO für die DEX und Mock-Behandlung enthält. Tauchen Sie eine einzelne Pflanze für 30 Sekunden in die Induktions- oder Scheinlösung ein.
Wiederholen Sie dies alle zwei bis drei Tage bis zur gewünschten Bildgebungszeit. Zu Beginn bereiten und wachsen Sie die Samen, wie im Textprotokoll beschrieben. Sechs bis sieben Tage nach der Keimung jeden Sämling in einem separaten Topf auf den Boden geben.
Wenn der Vorbau etwa einen Zentimeter lang ist, sprühen Sie das fluoreszierende SAM mit einer 10 bis 50 Mikromolaren-DEX-Lösung in Wasser. Für Induktion und Bildgebung in späteren Entwicklungsstadien, sAMs von längeren Stämmen oder Seitentriebe induzieren. 24 bis 48 Stunden nach der Induktion, sezieren Sie die SAMs und gehen Sie mit der Bildgebung.
Zuerst die Sämlinge von der Platte auf eine 10 Mikrogramm pro Millileter-Lösung von Propidiumjodid übertragen und fünf Minuten gegenstainen. Legen Sie die Wurzeln in eine Mikroskop-Bildkammer und stellen Sie sie mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 63-fachen Wassertauchobjektiv ab. Um die Propidiumjodidfluoreszenz zu visualisieren, verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und sammeln Emissionen zwischen 590 und 660 Nanometern.
Verwenden Sie für mTurquoise2-Fluoreszenz 458 Nanometer Anregung und sammeln Sie Emissionen zwischen 460 und 615 Nanometern mithilfe sequenzieller Scans. Fixieren Sie zunächst einen Stiel mit einem Finger auf der gegenüberliegenden Seite des gewünschten Abschnitts. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge ein Segment von etwa drei Zentimetern und führen Sie mehrere feine Schnitte durch.
Spülen Sie die Rasierklinge in einer Petrischale mit Leitungswasser und sammeln Sie die Stielabschnitte. Beflecken Sie die Abschnitte oder montieren Sie sie direkt auf Mikroskopschlitten. Für die Färbung einen Milliliter einer 250-Mikrogramm-Lösung pro Milliliter Propidiumjodid in einem Reaktionsröhre vorbereiten.
Entfernen Sie das Leitungswasser aus der Petrischale mit einer Pipette und ersetzen Sie es durch die Propidiumjodidlösung und färben Sie sie fünf Minuten lang. Entfernen Sie dann die Propidiumjodidlösung und spülen Sie sie mit Wasser ab. Übertragen Sie die gebeizten Abschnitte entweder mit feinen Zangen oder einem feinen Pinsel auf Mikroskopschlitten.
Verwenden Sie ein konfokales Laserscanmikroskop mit einer 25-fachen Tauchwasser-Tauchlinse, um die Proben abzubilden. Verwenden Sie ein 561 Nanometer Laserlicht, um Propidiumiodidfluoreszenz zu anregen und Emissionen von 570 bis 620 Nanometern zu sammeln. Verwenden Sie ein 405-Nanometer-Laserlicht, um den von den Treiberlinienkonstrukten kodierten mTurquoise2-Fluorophoreffektor zu erregen und Emissionen von 425 bis 475 Nanometern zu sammeln.
Verwenden Sie zunächst Zangen, um den Stiel zwei Zentimeter unter der Triebspitze zu schneiden. Halten Sie den Stiel in einer Hand und verwenden Sie feine Zange, um die Blütenknospen und große Primordien zu entfernen. Um junge Primordien zu entfernen, fixieren Sie das SAM in einer aufrechten Position in einer Petrischale, die drei Prozent Agarose enthält.
Als nächstes verwenden Sie ein Binokular und Zange, um alle jungen Primordien in der Nähe des SAM zu entfernen. Übertragen Sie das sezierte SAM in ein Rohr, das eine 250-Mikrogramm-Pro-Milliliter-Lösung propidiumiodid enthält. Lassen Sie die Probe fünf bis zehn Minuten färben, während Sie sicherstellen, dass die Probe während des Färbevorgangs vollständig unterGetaucht bleibt.
Legen Sie das gebeizte SAM in eine kleine Petrischale mit drei Prozent Agarosemedium. Bedecken Sie das SAM mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie ein konfokales Laserscanmikroskop, das mit einer 25-fachen Tauchwasser-Tauchlinse ausgestattet ist, um die sezierten SAMs abzubilden.
Verwenden Sie ein 561 Nanometer Laserlicht, um Propidiumiodidfluoreszenz zu anregen und Emissionen von 570 bis 620 Nanometern zu sammeln. Verwenden Sie ein 405-Nanometer-Laserlicht, um das mTurquoise2-Fluorophor zu anregen und Emissionen von 425 bis 475 Nanometern zu sammeln. Zeichnen Sie Bildstapel mit einer Länge von 50 Mikrometern in Z-Richtung mit einer Schrittgröße von 0,5 Mikrometern auf.
Die Induktion mit DEX führt zu einer zellspezifischen mTurquoise2-Expression im Wurzelendodermis der Phloem-Vorläufer und des Cambiums und der Stammzellen im triebapischen Meristem. Als Testfall für die Transaktivierung wird eine Effektorlinie generiert, die den sekundären Zellwandmaster-Transkriptionsfaktor VND7 kodiert, der mit der V16-Aktivierungsdomäne verschmolzen ist. Nach fünf Tagen Einzelbehandlung mit entweder 15 Mikroliter DEX oder DMSO werden Stammabschnitte für die Visualisierung der ektopischen Lignifikation in der Starthülle vorbereitet.
Die Startscheidezellen in induzierten Proben zeigen ein starkes Signal für den Propidiumjodidkanal und einige Zellen zeigen die typische Retikulatverdickung der Zellwand in Xylemzellen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie Sie die Genexpression in verschiedenen Geweben induzieren und wie Sie Ihre Proben auf die Bildgebung vorbereiten können. Nach diesem Verfahren können die etablierten Treiberlinien mit einer Vielzahl von Effektorkonstrukten verwendet werden, die von anderen Benutzern entsprechend ihren Forschungsinteressen erzeugt werden.
Diese Abkürzung sollte Pflanzenforschern helfen, die Wirkung einer zelltypspezifischen Expression oder des Knockdowns eines Gens von Interesse schnell zeitreserviert zu bewerten. Dieses zelltypspezifische Induktionssystem erfordert die Verwendung des Kortikosteroids Dexamethason. Direkter Kontakt sollte vermieden werden, daher ist es wichtig, während der Behandlung Handschuhe und eine Gesichtsmaske zu tragen.
