Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie über die Dynamik der Besiedlung und Infektion durch Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie repräsentativer für lebensmittelbedingte Infektionen beim Menschen ist und dass sie potenzielle Gewebeschäden bei Fischen im Vergleich zu oralen Gavage reduziert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Waschschritte aufgrund der sehr motilen Natur der Paramecia schwierig durchzuführen sein können.
Aus einer lebendigen Kultur, fügen Sie einen Milliliter Paramecium-Kultur und ein Milliliter einer e-coli MG1655-Kultur zu einem zehn Milliliter Gewebe Kulturkolben enthält acht Milliliter E3 Medium. Den Kolben leicht wirbeln, bevor man ihn bei 22 Grad Celsius hinlegt und einen Milliliter der Kokultur in einen neuen Zehn-Milliliter-Gewebekulturkolben mit neun Millilitern frischem E3-Medium übergibt, ergänzt durch 108 Koloniebildeinheiten pro Milliliter e-coli MG1655, alle zwei Wochen. Um die bakterielle Halbwertszeit innerhalb eines Parameciums zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der Paramecia aus einer optischen Dichte von 600 Paramecia-Bakterien Kokultur und fügen Sie eine 50 Mikroliter Aliquot von Überstand zu einem neuen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr jede Stunde für sechs Stunden.
Fügen Sie 950 Mikroliter eines ein Prozent nichtionischen Tensids in PBS zu den Röhren hinzu. Und lyse die Paramezie in jeder Probe mit einer Minute Wirbel, dann machen Eine von zehn Verdünnungen jeder Probe in sterilen PBS. Und 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf selektive Platten für eine 16-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag zählen Sie nur die isolierten und unterschiedlichen einzelnen Kolonien, um die Anzahl der Bakterienkolonien auf der Platte zu bestimmen. Und identifizieren Sie eine Platte mit einer Verdünnung, die 30-300 kolonienbildende Einheiten ergibt. Sammeln Sie am Tag vor der Infektion ein Bakterienvolumen aus einer optischen Dichte von 600 Kulturen pro Behandlung durch Zentrifugation.
Und die Pellets in einem Milliliter E3-Medium pro Röhre wieder aufhängen. Als nächstes fügen Sie jeder bakteriellen Suspension einen Mikroliter eines geeigneten bakteriellen Flecks hinzu. Und schützen Sie die Rohre Fotobleichen mit Folie.
Vor der Inkubation der Bakterienproben mit End-over-End-Rotation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Bakterien zweimal in einem großen Volumen von E3 Medium, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Und die Pellets in einem Milliliter frischem E3-Medium pro Röhre wieder aufhängen.
Dann fügen Sie einen Milliliter bakterielle Suspension zu jedem der beiden Kolben von frischen Paramecia pro Zustand für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur. Ziehen Sie den Inhalt beider Kolben pro Zustand in einzelne 50 Milliliter konische Rohre. Und pellet die Proben durch Zentrifugation.
Durch verwendung einer steriologischen Pipette etwa zehn Milliliter des E3-Überstandes in jedem Rohr durch zehn Milliliter frisches E3-Medium für 3 Waschungen durch Zentrifugation ersetzen. Nach der letzten Wäsche etwa zehn Milliliter der E3-Überwälstmittel entfernen, darauf achten, die Pellets nicht zu stören, und die Pellets in den restlichen zehn Millilitern E3-Medium wieder aufhängen. Übertragen Sie 500 Mikroliter jeder Suspension in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozenrifuge-Röhrchen und pellet die Paramecia durch Zentrifugation.
Entsorgen Sie 400 Mikroliter der Überräube und fügen Sie 20 Mikroliter 36,5 Prozent Formaldehydlösung zu den restlichen 100 Mikroliter Paramecia mit sanfter Pipettierung hinzu. Messen Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur das tatsächliche Gesamtvolumen in jedem Rohr per Pipette, bevor Sie die Anzahl der toten Paramecia pro Milliliter zählen. Bei einer lebensmittelbedingten Infektion des Zebrafisches die Parameciaproben auf zwei mal zehn bis fünf Paramecia pro Milliliter E3 mittlerer Konzentration verdünnen.
Und fügen Sie 3 Milliliter jeder Paramecia-Kultur zu einem Brunnen einer 6-Well-Platte pro Zustand hinzu. Als nächstes übertragen Sie zehn anästhesierte Zebrafische in einem minimalen Flüssigkeitsvolumen auf jeden Brunnen. Und die Kokulturen zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius in einem Tagesbruthaus bei Tageslicht bebrüten.
Um die Beuterate zu bestimmen, sehen Sie sich den fütternden Zebrafisch unter einem Stereomikroskop an, während Sie Videoaufnahmen von der Beuteaufnahme erhalten. Die Beuteerfassung ist durch das Schlagen eines Zebrafisches auf die Beute gekennzeichnet. Jeder Streik wird auf ein Beutefangereignis geschätzt.
Am Ende der Inkubation, waschen Sie den Zebrafisch in 5 verschiedenen Brunnen mit 3 Milliliter frisches E3-Medium mit 100 Milligramm pro Liter Tricain pro Brunnen ergänzt. Und betten Sie jeden Zebrafisch in 3 Milliliter von 1 Prozent Niedrigschmelz-Agarose in eine schwarze Well-Sechs-Well-Platte ein. Wenn alle Fische eingebettet sind, legen Sie die Platte unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie eine abgeschnittene Gel-Ladespitze, um sicherzustellen, dass sich die Köpfe auf der linken Seite und die Schwänze auf der rechten Seite in jedem Sichtfeld befinden.
Warten Sie 5 Minuten, bis die Agarose eingestellt ist, überlagern Sie dann die eingebetteten Fische mit frischem E3-Medium, das mit Tricain ergänzt wird, und stellen Sie den Zebrafisch auf einem Fluoreszenzmikroskop ab, um den Fortschritt der bakteriellen Infektionen zu bewerten. Bei pathogenen E-coli beträgt die anfängliche Bakteriendichte 790 Bakterien pro Paramecium, und die Bakterien werden innerhalb der Vakuole jedes Parameciumschnittatoms mit einer Halbwertszeit von etwa 2,3 Stunden abgebaut. Die Beute wird von einem charakteristischen auffälligen Verhalten begleitet, und die Bestimmung der Beuterate basiert auf der Annahme, dass jeder Schlag zur Internalisierung von 1 Paramecium führt.
Nach der Verdauung bewegen sich freie Bakterien vom Vorgut in den mittleren und hinteren Darm, wo sie etwa 1 bis 2 Stunden nach Beginn der Beute nachgewiesen werden. S-enterica, zum Beispiel, lokalisiert in erster Linie in der Darmschleimhaut mit einigen epitheliale Invasion führt zur Infiltration von Neutrophilen in das Epithel. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bestimmten Arten von Bakterien extrem gefährlich sein kann, und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der richtigen persönlichen Schutzausrüstung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
