Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Klebsiella-Feld zu beantworten, wie z. B. welche Gene verwendet werden, um Kapsel nagen und damit verbundene Virulent zu regulieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass es ein Mittel bietet, um kapselförmige und nicht-capsulated Stämme zu trennen, und es kann auch für schnelle Vergleiche zwischen Stämmen der Kapselproduktion verwendet werden. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um Kapselregulierung in Klebsiella zu studieren, Kann es auch auf verschiedene Bakterienarten angewendet werden.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, weil das Ausgießen der Farbverläufe und das Hinzufügen der Zellen zu den Gradienten ziemlich schwierig sein kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da wir die schwer zu beherrschenden Techniken zeigen und Vorschläge und Tipps bereitstellen, die dem Benutzer helfen. Um zu beginnen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer Stockplatte mit einer sterilen Schleife, und impfen 10 Milliliter einer geeigneten Brühe.
Inkubieren Sie die Kultur über Nacht. Dann übertragen Sie die Kultur auf eine 15 Milliliter Tube, und Zentrifuge. Als Nächstes entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter PBS wieder auf.
Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den resultierenden Überstand. Dann das Pellet in zwei Milliliter PBS wieder aufhängen. Um die Verdünnungen des Dichtegradienten zu erstellen, kombinieren Sie dichtegradientenmedium mit PBS.
Dann aliquot 600 Mikroliter jeder Gradientenverdünnung in einzelne zwei Milliliter-Röhren. Nehmen Sie 100 Mikroliter Zellen mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf und legen Sie die Pipettenspitze an der Seite des Rohres direkt unter den Meniskus eines der vielen Gradienten. Saugen Sie die Bakterienzellen sehr langsam auf den Gradienten, wobei Darauf geachtet wird, die Schnittstelle nicht zu mischen.
Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Rohre für 10 Minuten bei 8 000 g. Danach übertragen Sie die Rohre in ein Rack, um die minimale Gradientenverdünnung zu visualisieren, die erforderlich ist, um die Zellen direkt über der Gradientenschicht zu halten. Übertragen Sie zunächst einen Milliliter der verdünntesten Dichtegradientenverdünnung in ein Fünf-Milliliter-Rundbodenrohr.
Mit einer Spritze mit einer 1,5-Zoll-Nadel nehmen Sie einen Milliliter des nächstkonzentriertsten Dichtegradienten auf. Legen Sie die Nadel an die Unterseite des Rohres und injizieren Sie den Inhalt der Spritze sehr langsam. Bei jedem Schritt des Dichtegradienten muss eine klare Schnittstelle vorhanden sein.
Wenn sich die Schichten vermischen, erreichen Sie keine saubere Trennung Ihrer Bakterien. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Farbverlauf, um die Schnittstelle zwischen den Gradientenverdünnungen nicht zu stören. Legen Sie dann das Rohr in ein Rack.
Fügen Sie vorsichtig 600 Mikroliter der vorbereiteten Zellen an die Spitze des Farbverlaufs in der Röhre hinzu. Legen Sie dann das Rohr in einen Rohradapter und wiegen Sie das Rohr mit dem Adapter, um die Balance zu gewährleisten. Danach den Rohradapter in einen festen Winkelrotor innerhalb einer Tischzentrifuge platzieren und das Rohr 30 Minuten lang bei 3.000 g zentrieren.
Schließlich, nach der Zentrifugation, entfernen Sie das Rohr sorgfältig, legen Sie es in ein Rack, und fotografieren Sie die Ergebnisse. In diesem Protokoll wurde die Dichtegradientenzentrifugation verwendet, um Bakterienstämme basierend auf der Art und Weise, wie viel Kapsel sie produzieren, zu trennen. Obwohl die genauen Ergebnisse von der Bakterienart abhängen, wandern die meisten Stämme an einen einzigen Ort innerhalb des Gradienten.
Die Anwendung dieser Methode auf eine bakterielle Mutante-Bibliothek sollte ein Hauptband über dem Gradienten, ein weniger dichtes Band durch die oberste Schicht des Farbverlaufs und einen kleinen akapulären Bruch am unteren Rand erzeugen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Gradientenschnittstellen nicht gemischt werden sollten und der Gradient keine Luftblasen enthalten sollte. Im Anschluss an das Verfahren sollten Validierungsmethoden wie der Uronsäuretest oder die Mikroskopie durchgeführt werden, um Kapselmengen zu untersuchen.
Dies ist besonders wichtig, wenn diese Technik für neue Stämme verwendet wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gefahrengruppen 2-Erregern gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie Korrekturschutzausrüstung, Einhaltung von Risikobewertungen und ordnungsgemäße Entsorgung von Kulturen getroffen werden.
