Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Mechanobiologie beantworten, wie z. B. wie Kräfte innerhalb von Zellen sowie zwischen Zellen und ihrer Umgebung übertragen und wahrgenommen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf die molekularen Skaleninformationen darüber ermöglicht, wie Proteine auf mechanische Kräfte im nativen Kontext der lebenden Zelle reagieren. Obwohl diese Methode speziell auf die Untersuchung der fokalen Adhäsion Protein Vinculin angewendet wurde, Kann es auch auf andere mechanisch-empfindliche Proteine angewendet werden, wie Talin, Cadherine oder Nesprin.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die ordnungsgemäße Einrichtung der Bildgebung schwierig, aber für den Erfolg der Analyse erforderlich ist. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einem stabilen Ausdruck des Spannungssensorkonstrukts im gewünschten Zelltyp, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Substrate für die Zellaussaat vorzubereiten, erwerben Sie vier 35-Millimeter-Glasbodenschalen.
Arbeiten in einer Zellkulturhaube, in einem 15 Milliliter konischen Rohr, machen vier Milliliter von 10 Mikroliter pro Milliliter Fibronectin in sterilen Phosphat-gepufferten Saline-Lösung, oder PBS. Um die Röhre einmal sanft umkehren, um sie zu mischen und die Lösung fünf Minuten in der Zellkulturhaube sitzen zu lassen. Dann Pipette einen Milliliter Fibronectin-Lösung auf jede Glasbodenschale.
Lassen Sie die Fibronectin-Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf den Tellern. Dann die Fibronectin-Lösung aspirieren und einmal mit PBS abspülen. Lassen Sie einen Milliliter PBS auf den Tellern, bis die Zellen für die Aussaat bereit sind.
Nach dem Zählen der Zellen 30.000 Zellen auf jede fibronectinbeschichtete Glasschale mit dem entsprechenden Komplettmedium für ein Endvolumen von 1,5 Millilitern aus. Lassen Sie die Zellen vier Stunden nach der Aussaat ausbreiten. Bei zwei Stunden Der Ausbreitung, aspirieren Sie die Wachstumsmedien und spülen Einmal mit bildgebenden Medien.
Lassen Sie 1,5 Milliliter der Bildmedien. Erwärmen Sie das Mikroskop, wie im Textprotokoll beschrieben, bevor Sie mit der Kalibrierung beginnen. Um den FRAP-Laser zu kalibrieren, öffnen Sie zunächst das Laserkonfigurationsfenster.
Legen Sie die Einstellung Beleuchtung auf die entsprechenden FRAP-Beleuchtungseinstellungen für die Laserbelichtung der Probe fest. Legen Sie dann die Einstellung Beleuchtung auf die Beleuchtungseinstellungen fest, die für die Abbildung nur des Akzeptorfluorophors geeignet sind. Wählen Sie das zu kalibrierende Ziel unter Koordinatensystemeinstellung aus.
Deaktivieren Sie manuell auf Kalibrierungspunkte, und überprüfen Sie während der Kalibrierung Bilder anzeigen. Stellen Sie die Dwell-Zeit auf 10.000 Mikrosekunden und die Anzahl der Impulse auf 100 ein. Legen Sie nun den Kalibrierschlitten aus Ethidiumbromid, versiegelt zwischen einem Glasschlitten und einem Deckelschlupf, in den Bühnenadapter mit der Abdeckungsseite nach unten.
Verwenden Sie die Einstellungen für die Akzeptorbeleuchtung, um sich auf die Oberfläche des Dias zu konzentrieren, der als Brennebene mit dem hellsten Signal identifizierbar ist. Kleine Defekte in der Beschichtung werden sichtbar sein, um bei der Fokussierung zu helfen. Verschieben Sie die Folie in einen Bereich mit gleichmäßiger Fluoreszenz über die Bildebene.
Klicken Sie auf Einstellung Erstellen für die erste Kalibrierung oder Aktualisierungseinstellung für nachfolgende Kalibrierungen. Die Software initialisiert den Kalibrierungsprozess, bleicht automatisch und erkennt die Position des gebleichten Punktes. Stellen Sie eine erfolgreiche Kalibrierung sicher, indem Sie das endgültige Bild bewerten, bei dem es sich um ein dreimal dreirasterig gebleichtes Gitter mit gebleichten Punkten handelt, das gleichmäßig verteilt und fokussiert sein sollte.
Speichern Sie das Kalibrierbild zur späteren Referenz. Entfernen Sie das Kalibrierschiebeunden und speichern Sie es sicher. Die Kalibrierung sollte vor Beginn jedes Experiments durchgeführt werden, muss aber nicht zwischen den Proben durchgeführt werden.
Bereiten Sie das Mikroskopie-Setup für die Live-Zell-Bildgebung vor, vorzugsweise mit einem erhitzten Stadium und Objektiv, sowie einer Kohlendioxid-Kontrolle. Lassen Sie es 20 Minuten lang ausdemalibrate. Legen Sie nun eine der generierten Zellproben, die den Spannungssensor exemiten, zur Bildgebung in den Mikroskophalter.
Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang ausdemalibratieren. Um den Zustand der abgebildeten Zellen zu gewährleisten, halten Sie die Temperatur bei 37 Grad Celsius in der Bildkammer. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um befeuchtetes 5% Kohlendioxid über die Proben mit 15 Milliliter pro Minute zu übergeben, um den pH-Wert zu halten.
Öffnen Sie das Werkzeug Multi-Dimensional Acquisition oder MDA, und richten Sie es mit FRET-Bildparametern ein, einschließlich der verschiedenen Filtersätze. Speichern Sie diesen MDA im Experimentellen Ordner mit dem Namen MDA_FRET_date. Richten Sie einen weiteren MDA mit den FRAP-Bildparametern ein, einschließlich der verschiedenen Filtersätze, der Timelapse-Einstellungen und des Journals, um den Laser nach der Vorbleichenerfassung zu pulsieren.
Speichern Sie diesen MDA im Experimentellen Ordner mit dem Namen MDA_FRAP_date. Wählen Sie in der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm Journal, Aufnahme starten aus. Öffnen Sie das MDA-Fenster, laden Sie den MDA_FRET_date-Status und drücken Sie Acquire.
Laden Sie dann den MDA_FRAP_date Zustand und drücken Sie Acquire. Wählen Sie am Ende der Erfassung in der Symbolleiste oben auf dem Bildschirm Journal, Aufzeichnung beenden aus. Speichern Sie dieses Journal im Versuchsordner mit dem Namen FRETFRAP_date und fügen Sie es einer Symbolleiste für den einfachen Zugriff hinzu.
Schließen Sie das MDA-Fenster. Navigieren Sie in der Probe mit der Bildaufnahme unter Acquire, Acquire mit minimaler Belichtungszeit und neutralem Dichtefilter, um die von Interesse befindlichen Zellen zu identifizieren. Legen Sie den kontinuierlichen Autofokus fest, indem Sie zu Geräte, Fokus navigieren.
Konzentrieren Sie sich manuell auf die Probe, bis sie die richtige Bildebene erreicht. Klicken Sie auf Kontinuierlichen Fokus festlegen, und warten Sie, bis das System angepasst wurde. Sobald sich das System angepasst hat, klicken Sie auf Kontinuierliche Fokussierung starten.
Dann finden Sie eine Zelle, die den Spannungssensor mit klarer Lokalisierung zu einer Struktur von Interesse ausdrückt, und fangen Sie ein Bild. Zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse oder ROI, um hervorzuheben, wo zu bleichen. Speichern Sie diesen ROI-Standort.
Initialisieren Sie nun das FRETFRAP_date-Journal, das mit der Erfassung von FRET-Bildern beginnen wird, gefolgt von der Initialisierung des FRAP-Zeitraffers. Wiederholen Sie diese Schritte, bis 10 bis 15 Bildsätze erfasst werden. Analysieren Sie dann die FRET-FRAP-Daten wie im Textprotokoll beschrieben.
Hier sind repräsentative Ergebnisse für die FRET-Bildgebung des Vinkulin-Spannungssensors nach Segmentierung und Maskierung zur Isolierung von Fokaladesionen zu sehen. Räumliche Variation der Vinkulinbelastung kann über die Zelle gesehen werden. DIE FRAP-Bildgebung und -analyse kann durch die Fokale Haftstabilität beeinflusst werden.
Eine fokale Haftung, die sich während der Bildgebungsphase schnell umgibt, kann schwierig zu verfolgen sein. Oft wird dies durch eine FRAP-Kurve angezeigt, die Diskontinuitäten enthält und nicht interpretierbar ist. Bei einem Wildtyp-Vinkulin besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen Proteinlast und Fluktuationsrate, was darauf hindeutet, dass Vinkulin durch Gewalt stabilisiert wird.
Die Einführung einer Mutation in Vinculin, um seine Bindung an Talin zu bewirken, führt zu einer Umkehrung der Korrelation, was darauf hindeutet, dass Vinculin, das nicht in der Lage ist, Talin zu binden, durch Gewalt destabilisiert wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, Proben richtig vorzubereiten, sicherzustellen, dass die Zellen den Sensor auf endogenen Ebenen ausdrücken, und bildgebende Parameter sorgfältig auszuwählen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz, Messung der zellulären Skalendynamik oder herausfordernde Zellen mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie das Protein von Interesse mit anderen subzellulären Komponenten interagiert, um die Reaktion auf Kraft zu koordinieren.
