Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der Explosion verletzende traumatische Hirnverletzungen zu beantworten und kann verwendet werden, um neuroprotektive Medikamente vor der Verwendung von komplexeren in Vivo-Modellen zu überprüfen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein Laborinstrument verwendet, um in Vitro Massenhirngewebe einer Schockwelle auszusetzen, indem ein einfaches und hohes Durchsatzprotokoll verwendet wird, das die Bildung einer reproduzierbaren Verletzung ermöglicht. Legen Sie zunächst sterile, maßgeschneiderte Edelstahlringe in die Brunnen einer sechs Brunnenplatte ein.
Dann fügen Sie vorgewärmte serumfreie experimentelle Medium mit Propidiumiodid zu den Brunnen, um sicherzustellen, dass das Niveau des Mediums nicht über die Kerbe des Rings zu erreichen. Übertragen Sie die Platte für eine Stunde auf den Inkubator, um sicherzustellen, dass das Medium bei 37 Grad Celsius ist, bevor die Gewebekultureinsätze übertragen werden. Nach einer Stunde, übertragen Gewebekultur Einsätze mit organotypischen Scheiben aus ihren Wachstumsschalen auf die Ringe in der sechs Brunnenplatte.
Machen Sie einen Punkt auf der Einlegefelge in der Drei-Uhr-Position mit einem permanenten Marker-Stift, um die Rückkehr der Einsätze in ihre ursprüngliche Position zu erleichtern, dann beschriften Sie jede sechs Brunnenplatte mit einem eindeutigen Namen und Datum und machen Sie eine Karte der Brunnen jeder Platte, wobei jeder Brunnen mit einem Buchstaben und jede Scheibe im Brunnen mit einer Zahl benannt wird, so dass jede Scheibe einen eindeutigen Bezeichner hat. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um sicherzustellen, dass die Scheiben bei 37 Grad Celsius unmittelbar vor der Bildgebung sind. Bewerten Sie eine Stunde nach der Übertragung auf das experimentelle Medium die Schnittzustandsgesundheit, indem Sie jede Scheibe unter geringer Leistung schnell einzeln und sequenziell darstellen.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einem geeigneten Anregungs- und Emissionsfilter ausgestattet ist, idealerweise in einem dunklen Raum oder in einem Raum mit dunklem Licht. Halten Sie den Deckel auf der Platte, wenn Sie bildgeben. Auf der Innenseite des Deckels kann sich etwas Kondensation aufbauen.
Wenn dies geschieht, verwenden Sie kurz einen Haartrockner auf der niedrigen Einstellung auf der Außenseite des Deckels. Stellen Sie sicher, dass die bildgebenden Bedingungen an verschiedenen Tagen und zwischen den Experimenten identisch sind. An der Grundlinie zeigen gesunde Scheiben sehr wenig fluoreszierende Färbung.
Scheiben, die Bereiche mit dichter roter Färbung aufweisen, weisen auf eine beeinträchtigte Lebensfähigkeit hin und sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Zum Vergleich: Fluoreszenz aus der explosionsverletzten Scheibe nach 72 Stunden wird hier gezeigt. Unmittelbar nach der Bildgebung einen Gewebekultureinsatz aus der sechs Brunnenplatte entfernen und vorsichtig in einen sterilen Polyethylenbeutel mit 20 Millilitern vorgewärmtem Versuchsmedium mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid übertragen.
Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen und versiegeln Sie den sterilen Beutel, indem Sie die Oberseite verdrehen und eine Kunststoffklemme auftragen. Stellen Sie sicher, dass jeder sterile Beutel korrekt mit der Platte und der gut gekennzeichneten Karte gekennzeichnet ist. Nach der Übertragung jedes Gewebekultureinsatzes in einen individuellen sterilen Beutel legen Sie die Beutel und die sechs Brunnenplatten mit experimentellem Medium in den 37 Grad Celsius Inkubator.
Nach einer Stunde die sterilen Beutel mit den Gewebekultureinsätzen vorsichtig in Plastikboxen in einer thermisch geregelten Box verpacken, die bei 37 Grad Celsius mit dem ionisierten Wasser gefüllt ist. Das Wasser sollte die organotypischen Scheiben während des schockwellen-Expositionsprotokolls bei physiologischer Temperatur halten. Tragen Sie bei der Vorbereitung des Stoßrohrs und der Stoßwellenbelastung Schutzstiefel mit Stahltoed, einen Labormantel und Handschuhe.
Verwenden Sie einen Ausblendstab, um den sterilen Beutelhalterrahmen an den Disthunflansch des Stoßrohrs zu schrauben, um sicherzustellen, dass das zentrale Loch am Stoßrohrauslass ausgerichtet ist. Sensor eins, ein Druckwandler, befindet sich im mittleren Teil des angetriebenen Abschnitts, und Sensor zwei befindet sich im distalen Flansch des Stoßrohrs. Verbinden Sie diese Druckwandler über ein Stromaggregat mit einem Oszilloskop und schalten Sie das Oszilloskop ein.
Stellen Sie sicher, dass das Magnetventil und die Durchflussregelung des Stoßrohrs geschlossen sind, öffnen Sie dann die externe Druckluftleitung und laden Sie das Magnetventil auf 2,5 bar. Öffnen Sie das Druckluftzylinder-Sicherheitsventil und öffnen Sie langsam den Druckregler, um den Druck auf etwa fünf bar zu erhöhen. Als nächstes bereiten Sie Membranen vor, indem Sie 23 Mikron dicke Polyesterplatten in 10 mal 10 Zentimeter Quadrate schneiden.
Bereiten Sie Griffe aus Autoklavenband vor und kleben Sie sie an die Ober- und Unterseite jeder Membran. Positionieren Sie eine Membran in der Verletzung und stellen Sie sicher, dass sie zentriert sind. Als nächstes klemmen Sie die Membran mit vier M24-Schrauben und Muttern.
Gestalten Sie sie sequenziell diagonal symmetrisch und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Membranen faltenfrei sind. Klemmen Sie einen sterilen Beutel in einer vertikalen Position auf dem Halterrahmen, um sicherzustellen, dass die Oberfläche der Gewebekultur mit den organotypischen Hippocampusscheiben mit dem Stoßrohrauslass und dem Gewebekultureinsatz im sterilen Beutel zentriert ist. Bei der Doppelmembrankonfiguration ist der Berstdruck vom Gasdruckunterschied zwischen Fahrer und Doppelbruchkammer abhängig.
Damit die Membranen kontrolliert platzen, wird das doppelte Sicherheitsventil manuell geöffnet, sobald die Zieldrücke erreicht sind. Legen Sie Ohrenschützer und Sicherheitsbrillen an, wenn sie nicht bereits getragen sind. Schließen Sie das Magnetventil.
Schalten Sie das aktuelle Ausgangsnetzteil ein, um die Schockwellendaten zu erfassen. Manipulieren Sie den Durchflussregler am Dämpferrohr-Bedienfeld, um den Treibervolumenabschnitt des Stoßrohrs für die Konfiguration der einzelnen Membran oder sowohl den Treibervolumenabschnitt als auch den doppelten Bruchabschnitt des Stoßrohrs für die Konfiguration der Doppelmembran langsam unter Druck zu setzen. Sobald die Membran bricht, den Druckluftstrom über den Durchflussknopf schnell geschlossen und das Magnetventil geöffnet.
Die ideale Kombination von Stoßwellenparametern sollte ausreichen, um Gewebeverletzungen zu verursachen, aber nicht so hoch, dass sie Gewebekultureinsatz oder sterile Beutelverzerrung oder Bruch verursacht. Nachdem Sie jede Scheibe einer einzigen Stoßrohrwelle aussetzen, kehren Sie sie sofort in die thermisch regulierte Box zurück. Dann nehmen Sie den nächsten sterilen Beutel aus der Box und klemmen Sie ihn auf den Halterrahmen.
Führen Sie den Schalter reibungslos und schnell aus, um eine Abkühlung des Versuchsmediums zu verhindern, da Temperaturen unter 37 die Verletzungsentwicklung beeinträchtigen können. Sobald alle Gewebekultureinsätze einer Schockwelle oder einem Scheinprotokoll ausgesetzt sind, geben Sie die Gewebekultureinsätze in ihre Brunnen in der ursprünglichen sechs Brunnenplatte zurück und kehren bis zur weiteren Abbildung zum Inkubator zurück. Dieses Bild ist ein repräsentatives Beispiel für eine Schockwelle, die mit einer 23 Mikrometer dicken Polyesterfolie mit 55 Kilopascal-Spitzenüberdruck gewonnen wurde.
Die Stoßwellengeschwindigkeit betrug 440 Meter pro Sekunde. Sowohl 50- als auch 55-Kilopascal-Spitzenüberdruck-Schockwellen verursachten erhebliche Verletzungen, die sich während des 72-Stunden-Protokolls im Vergleich zur Scheingruppe entwickelten. Die Verletzung, die durch eine Exposition bei einer Überdruckwelle von 55 Kilopascal resultierte, war signifikant höher als nach 50 Kilopascal nach 48 Stunden und 72 Stunden, was zeigt, dass die Entwicklung der Verletzung proportional zur Intensität der Schockwelle ist.
Dieses Bild zeigt eine Scheibe 72 Stunden nach einer 50-Kilopascal-Explosion. Ein hohes Maß an diffusen Verletzungen ist sichtbar. Die Verletzung ist nach einer 55 Kilopascal-Spitze überdemdruckiger.
Dieses Propidium-Iodid-Fluoreszenzbild zeigt eine organotypische Scheibe aus einem Scheinexperiment. Die Scheinscheibe zeigt ein niedriges Fluoreszenzniveau. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine aseptische Technik während der gesamten Zeit beizubehalten, um eine Kontamination des Gewebes zu vermeiden und Gewebekulturen schnell, aber sehr sanft zu manipulieren, um unbeabsichtigte Zellschäden zu vermeiden.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Mechanismen des Zelltods bei explosionsinduzierten traumatischen Hirnverletzungen beteiligt sind? Diese Technik ermöglicht einen Test mit hohem Durchsatz für Forscher auf dem Gebiet des Neuroprotektions, um das Potenzial für Medikamente zu erforschen, um die Ausbreitung von Zelltod und Hirngewebe nach der Exposition gegenüber Explosionsschockwellen zu verhindern.
